<<
>>

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Одной из особенностей современной экономики является всё более возрастающая значимость нанотехнологий и производимой с её помощью нанопродукции. Благодаря широкомасштабному внедрению современных нанотехнологичных разработок происходит активное обогащение мирового рынка, как первичной нанопродукцией, так и изделиями, в состав которых входят нанокомпоненты.

По прогнозам в ближайшей перспективе количество и разнообразие наноматериалов, экспонирующих население, будут стремительно возрастать [27,33,52,55].

В соответствии с законодательством Российской Федерации и международными требованиями к безопасному регулированию химических веществ (СПМРХВ, ВОЗ, МОТ, ОЭСР) наноматериалы, учитывая их особые физико-химические свойства, относятся к новым видам продукции, характеристика потенциального риска которых для здоровья человека является обязательной.

В связи с этим, в соответствии с «Концепцией токсикологических исследований, методологии оценки риска, методики идентификации и количественного определения наноматериалов», утвержденной Постановлением Главного государственного санитарного врача от 31 октября 2007 года №79, перед Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека стоит задача по экспертной оценке токсичности наноматериалов и наносодержащей продукции, изготовленной и обращающейся на территории Российской Федерации и других стран ЕврАзЭС.

По состоянию на декабрь 2013 на российском рынке представлено 648 наименований продукции, содержащих наночастицы. Преобладающее место в потребительской продукции наноиндустрии занимает парфюмерно- косметическая (73%) и пищевая продукция (8%). Отмечено также применение нанотехнологий при производстве упаковочных материалов,

средств бытовой химии, лекарственных средств, лакокрасочной продукции и отдельных других видов потребительских товаров. Среди наиболее часто используемых наноматериалов наночастицы серебра, золота, цинка, титана, кремния, наносомы [55].

По итогам исследований, проведенных в 2013 году международным научным центром имени Вудро Вильсона 1628 зарегистрированных товаров личного и бытового назначения содержат наночастицы серебра, титана диоксида, цинка, фуллерены [112].Среди них продукция, имеющая в своём составе наноформы титана диоксида, благодаря уникальным физико- химическим характеристикам и пролонгированному антибактериальному эффекту является одной из самых востребованных [3].

Такое широкое применение наноразмерных частиц серебра, титана и цинка в производстве различных видов продукции для всех категорий населения указывает на чрезвычайную актуальность их токсиколого- гигиенической оценки.

В последние годы в Российской Федерации появились научно- исследовательские работы, посвященные изучению токсических свойств наноразмерных частиц серебра, цинка и титана.

Так, в работе Распопова Р.В. было установлено, что НЧ диоксида титана в дозе до 100 мг/кг способны проникать через барьер желудочно- кишечного тракта и накапливатся в печени, при этом проницаемость кишечного барьера зависела не только от дозы, но и от формы НЧ титана диоксида, которая может быть сферической, в виде цилиндра или параллелепипеда. В данных исследованиях была выявлена также высокая биодоступность НЧ цинка и его распределение в органах и тканях [38].

Исследования Смирновой В.В, изучавшей приоритетные наноматериалы используемые в упаковке пищевых продуктов (серебро, диоксид титана, диоксид кремния и наноглина) показали, что наибольшее влияние на организм лабораторных животных оказывали наночастицы серебра. Количество наночастиц серебра, мигрировавших из упаковочных

материалов зависело от состава модельных сред и составляло от 2,46 мкг/кг. (50% спиртовой раствор) до 331 мкг/кг (растительное масло) [46].

Следует отметить, что в изученных научно-исследовательских работах представлены сведения о токсичности наноразмерных частиц серебра, цинка и титана, полученные в исследованиях на экспериментальных животных, данные об исследованиях на альтернативных моделях в экспериментах in vitro отсутствуют.

Количество промышленно производимых НМ и наносодержащей продукции ежегодно существенно увеличивается [8,36], что затрудняет проведение оценки безопасности всех важнейших НМ обычными классическими токсикологическими методами, т.к. для этого необходимы время, большие трудозатраты и материальные ресурсы. Одним из путей интенсификации исследований и снижения их себестоимости является применение ускоренных токсикологических исследований на простых биологических системах, позволяющих проводить испытания in vitro. Поэтому разработка и внедрение альтернативных методов in vitro стала одним из ведущих направлений токсикологических исследований в мире. При правильном подходе опыты in vitro дают информацию об уровне токсичности, её клеточных и молекулярных механизмах [23].

В отечественной и зарубежной науке и практике для оценки токсичности химических веществ предлагаются к использованию различные тест-системы, альтернативные моделям in vivo (простейшие организмы, микроорганизмы, клеточные и субклеточные элементы, различные гидробионты, растения).

Необходимо отметить, что имеющиеся результаты исследований на гидробионтах [12,115,126,146] более приемлемы в области экологической токсикологии, а исследования на культурах клеток [65,68,70,76,77,84,86,95,102,131,140,148] позволяют оценить лишь узкоспецифическое действие, что не всегда отвечает задачам Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия

человека по экспертной оценке токсичности НМ и наносодержащей продукции.

Несмотря на то, что в настоящее время уже накоплен значительный экспериментальный материал по оценке токсичности некоторых НМ для живых организмов, большинство имеющихся исследований выполнено с помощью разнообразных методик и тест систем (простейших организмов, микроорганизмов, клеточных и субклеточных элементов, гидробионтов и растений), причём полученные при этом результаты часто не сопоставимы между собой, а также с данными полученными на млекопитающих. Необходимо отметить, что данные альтернативные модели не применяются при проведении экспертной оценки готовой продукции, в т.ч.

содержащей наноматериалы (парфюмерно-косметическая продукция, товары бытовой химии, изделия медицинского назначения, товары для детей и др.).

Сегодня органами и организациями Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека активно применяются для оценки токсикологических показателей безопасности продукции непродовольственного назначения такие альтернативные модели, как фотобактерии «Эколюм», сперма КРС и сосуды ХАО куриного эмбриона, в соответствии с требованиями Технических Регламентов Таможенного Союза – ТР ТС 009/2011 «О безопасности парфюмерно- косметической продукции», ТР ТС 008/2011 «О безопасности игрушек», утвержденных 23 сентября 2011г. и Едиными санитарно- эпидемиологическими и гигиеническими требованиями к товарам, подлежащим санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю) раздел 5. Требования к товарам бытовой химии и лакокрасочным материалам и раздел 20. Требования к дезинфицирующим средствам, утвержденных 17 августа 2010 г.

Используемые в ходе экспериментальных исследований тест объекты имеют легко регистрируемые показатели функционального состояния тест- объекта (тест-функции), характеризующие фундаментальные процессы их

жизнедеятельности (биолюминесценция, подвижность сперматозоидов, линейная скорость кровотока), и ряд преимуществ перед другими альтернативными моделями: достаточная чувствительность, корреляции с результатами оценки на целостном организме млекопитающих, стандартизованное производство, удобство транспортировки и хранения, отсутствие стерильности при хранении и проведении анализа, низкая стоимость испытания и высокая технологичность анализа с объективной цифровой оценкой результатов, повышающей их достоверность. Альтернативные методы исследования с помощью фотобактерий «Эколюм», спермы КРС аккредитованы в немецкой системе аккредитации DAKKS № D- PL-14246-01-00.

Всё возрастающая на рынке страны номенклатура продукции, содержащей нановещества и НМ и стоящие перед Роспотребнадзором задачи обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения требуют при проведении экспресс-оценки инновационных продуктов наноиндустрии использования альтернативных методов in vitro, наиболее эквивалентных методам in vivo. В связи с этим возникает проблема необходимости выбора среди разнообразных методик и тест-систем таких, которые были бы наиболее информативны, стандартизованы, имели объективную цифровую оценку результатов и хорошо коррелировали с данными, полученными на животных. Стоит обратить внимание, что в доступной литературе отсутствует информация о сравнительной оценке общетоксического и раздражающего действия наноразмерных частиц серебра, цинка и титана в экспериментах in vivo и in vitro. Это и определило цель нашего исследования: сравнительная оценка эффективности экспресс- методов исследования токсических свойств наноматериалов.

Научные исследования были построены таким образом, что на первом этапе осуществлялась сравнительная оценка общетоксического действия наноразмерных частиц серебра в экспериментах in vivo и in vitro.

При изучении общетоксического действия в экспериментах in vivo было установлено, что по показателям среднесмертельной дозы наноразмерные частицы серебра, цинка и титана при однократном внутрижелудочном пути поступления относятся к малоопасным веществам (4 класс опасности, DL>5000 мг/кг).

В условиях данного эксперимента, несмотря на отсутствие летальности при однократном внутрижелудочном введении наноразмерных частиц серебра в дозе 5000 мг/кг (150 мг/ животное) отмечались признаки токсического действия на центральную нервную систему (табл. 30), проявляющиеся достоверным изменением двигательной активности животных (P5000 мг/кг общетоксическое действие не выявлено* Острая токсичность (14 дней)

150 мг/ животное

(5000 мг/кг)

DL50>5000 мг/кг общетоксическое действие не выявлено* Острая токсичность (14 дней)

30 мг/ животное (1000 мг/кг)[125]

Субхроническая токсичность(28 дней) 0,9 -2,7 мг/животное

(30- 90 мг/кг) [109, 154]

Хроническая токсичность(6 мес.) 0,005 мг/мл (5 мг/л) [41]

Субхроническая токсичность (28 дней)

15 мг/животное (500 мг/кг)[88,144] Субхроническая

токсичность(28 дней) 10 -15 мг/животное

(200-500 мг/кг) [144,158]

Хроническая токсичность (90 дней)

0,3 мг/животное (10 мг/кг) [80]

Эксперименты in vitro (Альтернативные модели) 0,005 мг/мл (2 дня)

на одну пробу спермы* 0,001 мг/мл (1 день)

на одну пробу бактерий* 20 мг/мл (2 дня)

на одну пробу спермы* 0,005 мг/мл (1 день)

на одну пробу бактерий*

0,2 мг/мл (1 день)

на одну пробу бактерий* 0,002-0,005 мг/мл (1-2 дня)

на клеточных культурах [77] 0,005 мг/мл на культуру (1-2 дня)

пневмоцитов [77] 0,2 мг/мл

на клеточных культурах[71]

Как показывает сравнительный анализ (табл. 31), признаки общетоксического действия наноразмерных частиц серебра в опытах in vivo отмечались в дозах 30-150 мг/животное при изучении острой токсичности, в дозах 0,9-2,7 мг/животное в опытах по субхронической токсичности и в дозах 0,005 мг/мл при проведении длительных экспериментов на животных.

Общетоксическое действие наноразмерных частиц серебра в опытах in vitro было выявлено в концентрациях 0,001- 0,005 мг/мл на одну пробу культуры (табл. 30), что показывает очень высокую чувствительность используемых моделей. Аналогичные величины эффективных токсических концентраций (0,002-0,005 мг/мл) были получены Gliga R., Skoglund S. в экспериментальных исследованиях по изучению токсичности наноразмерных частиц серебра в опытах in vitro и на клетках человеческого лёгкого [77].

Следующим этапом научной работы было изучение общетоксического действия наноразмерных частиц цинка на экспериментальных животных in vivo и альтернативных моделях in vitro. При изучении общетоксического действия наноразмерных частиц цинка в экспериментах in vivo было установлено, что при остром воздействии доза 5000 мг/кг (150 мг/ на одно животное) не оказывает общетоксического эффекта и не вызывает признаков интоксикации и патоморфологических нарушений. Вместе с тем, в литературе имеются сведения о проявлении общетоксического действия наноразмерных частиц цинка в экспериментах in vivo при введении более низких доз, но в исследованиях по изучению субхронической токсичности.

В исследованиях Shrivastava R., Raza S., Yadav A. et al. [144] при введении мышам дозы 500 мг/кг (15 мг/ на одно животное) отмечались признаки окислительного стресса в виде повышения уровня активных форм кислорода (АФК) и антиоксидантых ферментов, дофамина и норадреналина в мозговой коре головного мозга. Анализ результатов трансмиссионной электронной микроскопии (ПЭМ) выявил присутствие наночастиц цинка в цитоплазме и ядре клеток печени и мозга.

В работах других авторов Jo E., Seo G., Kwon J.T. et al. по изучению субхронической токсичности, при введении крысам за 2 недели до спаривания дозы 500 мг/кг (15 мг/ на одно животное) отмечалось снижение количества и массы тела их потомства. Наночастицы цинка были обнаружены в молочной железе, матке, печени взрослой особи и в почках детенышей. Результаты проведенных исследований показали, что наночастицы цинка могут представлять риск для здоровья беременных женщин и их плода [88].

В результате экспериментальных исследований по изучению общетоксического действия в опытах in vitro было установлено, что наноразмерные частицы цинка оказывают дозозависимое действие на альтернативные модели сперма КРС и фотобактерии «Эколюм». Подвижность сперматозоидов снижали концентрации 20 г/л, 30 г/л, 40 г/л, 50 г/л и тушение свечения биосенсора по сравнению с контролем вызывали концентрации 2·10-3 г/л, 3·10-3 г/л, 4·10-3мг/л, 5·10-3 мг/л. В соответствии с классификацией токсичности наноразмерные частицы цинка относятся к высокотоксичным соединениям для данной альтернативной модели.

Проведенный сравнительный анализ общетоксического действия наноразмерных частиц цинка в опытах in vivo показал, что изучаемое вещество в дозе 150 мг/животное не обладает острой токсичностью, тем не менее, в условиях субхронического эксперимента признаки интоксикации отмечались в дозе 15 мг/животное (табл. 31).

Сравнительный анализ изучения общетоксического действия в опытах in vitro показал, что эффективная токсическая концентрация наноразмерных частиц цинка для альтернативной модели фотобактерий «Эколюм» составила 0,005 мг/мл на одну пробу культуры, а для модели спермы КРС - 20 мг/мл на одну пробу сперматозоидов (табл. 30). Полученные результаты указывают на более высокую чувствительность альтернативной модели фотобактерий

«Эколюм». По имеющимся литературным данным аналогичные эффективные токсические концентрации (0,005 мг/мл) были получены при

исследовании токсичности наноразмерных частиц цинка на пневмоцитах человека [131].

На следующем этапе изучения общетоксического действия наноразмерных веществ в опытах in vivo и in vitro проводили исследование токсичности наноразмерных частиц титана диоксида. При изучении общетоксического действия наноразмерных частиц титана диоксида в экспериментах in vivo было установлено, что при остром воздействии доза 5000 мг/кг (150 мг/ на одно животное) не вызывает общетоксического эффекта: отсутствуют признаки интоксикации и патоморфологических нарушений. Тем не менее, в литературе имеются сведения о признаках общетоксического действия наноразмерных частиц титана диоксида, вызванных более низкими концентрациями, в субхроническом эксперименте.

В исследованиях Shrivastava R., Raza S., Yadav A. et al. при пероральном введении мышам в течение 28 дней дозы 500 мг/кг (15 мг/ на одно животное) отмечались признаки окислительного стресса в виде повышения уровня активных форм кислорода (АФК) и антиоксидантых ферментов, дофамина и норадреналина в мозговой коре головного мозга. Анализ результатов трансмиссионной электронной микроскопии (ПЭМ) выявил наличие наночастиц титана диоксида в цитоплазме и ядре клеток печени и мозга [144].

Wang Y., Chen Z., Ba T., et al. в своих исследованиях отмечали общетоксическое действие наноразмерных частиц титана диоксида при воздействии более низких доз. После введения крысам 3 недельного возраста (молодая особь) и 8 недельного возраста (взрослая особь) в течение 30 дней дозы 200 мг/кг (10 мг/ на одно животное) было установлено, что наночастицы титана диоксида индуцируют различные токсические воздействия на молодых и взрослых крыс. Наблюдались значительно более выраженные изменения в группе молодых крыс, проявляющиеся повреждением печени и почек, отмечались признаки окислительного стресса в виде повышения уровня восстановленного глутатиона (GSH). Эти

результаты позволили предположить, что молодые организмы являются более чувствительными к воздействию наноразмерных частиц титана, чем взрослые особи [161].

В исследованиях Gui S., Sang X., Zheng L., et al. в ходе хронического эксперимента наблюдалось общетоксическое действие наноразмерных частиц титана диоксида при введении дозы 10 мг/кг (0,3 мг/животное) в течение 90 дней. В данном исследовании наблюдались признаки индуцированной нефротоксичности животных, проявившиеся почечно- клеточным апоптозом и окислительным стрессом. Отмечалась иммунно- воспалительная реакция, сопровождавшаяся увеличением клеточного ответа (увеличение уровня клеточных антител: Axud1, Cyp4a12a, Cyp4a12b, Cyp4a14, Cyp2d9). Кроме того, анализ микрочипов выявил значительные изменения экспрессии генов [80].

В результате экспериментальных исследований по изучению общетоксического действия на моделях in vitro было выявлено, что наноразмерные частицы титана диоксида оказывают дозозависимое действие на альтернативную модель фотобактерии «Эколюм» в концентрациях 2,5·10-1 г/л, 2,5 г/л, 25 г/л и 250 г/л вызывая тушение свечения биосенсора по сравнению с контролем.

В условиях данного эксперимента наноразмерные частицы титана не оказывали общетоксического действия на альтернативную модель спермы КРС в концентрациях 250 г/л, 300 г/л, 400 г/л индекс токсичности находился в нормативном интервале (70-120%).

Проведенный сравнительный анализ (табл. 31) общетоксического действия наноразмерных частиц титана диоксида в опытах in vivo показал, что изучаемое вещество в дозе 150 мг/животное не обладает острой токсичностью, в то время как в условиях субхронического эксперимента признаки интоксикации отмечались в дозах 3-15 мг/животное. При проведении длительных экспериментов на животных токсичной была доза 0,3 мг/животное.

Сравнительный анализ изучения общетоксического действия в опытах in vitro (табл. 31) показал, что эффективная токсическая концентрация наноразмерных частиц титана диоксида была на уровне 0,2 мг/мл на одну пробу фотобактерий «Эколюм», что указывает на высокую чувствительность данной модели. Аналогичные величины эффективных токсических концентраций были получены при исследовании токсичности наноразмерных частиц титана диоксида и на лимфоцитах периферической крови, макрофагах, эпителиальных клетках дыхательных путей и кишечника человека [71].

Результаты сравнительных исследований общетоксического действия в экспериментах in vivo и in vitro показали что, несмотря на то, что наноразмерные частицы серебра, цинка и титана диоксида не вызывают гибели лабораторных животных при однократном остром внутрижелудочном воздействии дозы 5000 мг/кг, они способны оказывать токсическое действие на организм человека на клеточном уровне.

Следует отметить, что исследования по изучению общетоксического действия наноразмерных частиц серебра, титана и цинка в длительных субхронических и хронических экспериментах на животных проводились с использованием высокотехнологичного оборудования, которое в обычной практике при проведении санитарно-эпидемиологической экспертизы не применяется, в виду отсутствия возможности оснащения испытательных лабораторных центров таким дорогостоящим оборудованием и ограниченностью сроков проведения экспертизы (не более 1 месяца).

При этом, как показали результаты исследований, чувствительность используемых нами методов in vivo не позволяет выявить токсическое действие в острых опытах, для этого необходимо проведение длительных экспериментов на животных с применением высокотехнологичного оборудования, тогда как чувствительность методов in vitro способна выявить токсический эффект даже в острых опытах.

Результаты исследований показали высокую чувствительность альтернативных моделей и их способность в остром опыте улавливать токсический эффект тех доз, которые вызывают подобный эффект у животных лишь в условиях длительных экспериментов и требуют использования высокочувствительного специального оборудования.

Этот факт чрезвычайно важен, так как использование альтернативных методов позволит получить скрининговую оценку токсичности исследуемых наноматериалов или наносодержащей продукции, что очень актуально в условиях нарастающих объемов токсикологической экспертизы.

Учитывая увеличение на рынке ассортимента и объемов наносодержащей продукции, с которой человек имеет длительный контакт (парфюмерно-косметическая продукция, упаковка продуктов питания, медицинские изделия и т.д.), достаточно низкие дозы наноразмерных частиц, в условиях продолжительного воздействия, могут оказывать токсическое действие на организм человека. Известно также, что одной из важных проблем профилактической токсикологии является проблема воздействия сверхмалых количеств вещества и возникновение парадоксальных эффектов [23].

Заключительным этапом экспериментальных исследований было изучение раздражающего действия наноразмерных частиц серебра, цинка и титана диоксида в экспериментах на животных in vivo и на альтернативных моделях in vitro.

При проведении исследований по изучению раздражающего действия в экспериментах in vivo было выявлено, что наноразмерные частицы серебра не оказывают раздражающего действия на кожные покровы, но умеренно раздражают слизистые оболочки. Уже через 1 час после внесения в коньюктивальный мешок глаза кролика раствора наноразмерных частиц серебра отмечались гиперемия коньюктивы глаза, которая оценивалась в 2 балла (отдельные сосуды трудно различимы), отёк века- 1 балл (слабый) и наличие выделений – 1 балл (минимальные, в углу глаза). Общая суммарная

оценка раздражающего действия на слизистую глаз составила 4 балла, что позволяет отнести НЧ серебра к умеренно раздражающим веществам.

Способность наноразмерных частиц серебра раздражать слизистые оболочки была подтверждена исследованиями в опытах in vitro на сосудах ХАО куриного эмбриона (табл. 32). Об этом свидетельствует статистически достоверное различие между контрольной и опытной группой по показателю изменения линейной скорости кровотока (Х) на 16,4% (P0,05

(Vs)n*- линейная скорость кровотока в динамике измерений (Vs)0**- линейная скорость кровотока на нулевой минуте Х(%)***-изменение линейной скорости кровотока

σ****- среднее квадратическое отклонение

Наноразмерные частицы цинка и титана диоксида не оказывали раздражающего действия на кожные покровы и слизистые оболочки лабораторных животных, что подтвердилось исследованиями в опытах in vitro на сосудах ХАО куриного эмбриона. Показатели изменения линейной

скорости кровотока (Х) не превысили допустимый нормативный уровень (15%) и составили 3,4±2,1% при воздействии наноразмерных частиц цинка и 4,0±2,0% при воздействии наноразмерных частиц титана диоксида (табл. 32).

Результаты сравнительной оценки раздражающего действия наноразмерных частиц серебра, цинка и титана диоксида в экспериментах in vivo и in vitro представлены в таблице 33.

Таблица 33

Сравнительная оценка раздражающего действия на слизистые оболочки наноразмерных частиц серебра, цинка и титана диоксида в

экспериментах in vivo и in vitro

Вид исследования Наноразмерные частицы
Ag Zn TiO2
Эксперименты in vivo (Животные) Наличие

раздражающего действия

(4 балла)

Отсутствие

раздражающего действия

(0 баллов)

Отсутствие

раздражающего действия

(0 баллов)

Эксперименты

in vitro (Сосуды ХАО куриного эмбриона)

Наличие раздражающего действия

(Х)= 16%

Отсутствие раздражающего действия

(Х)= 3,4%

Отсутствие раздражающего действия

(Х)= 4,0%

В заключении следует отметить, что полученные в ходе проведенной сравнительной оценки результаты общетоксического и раздражающего действия наноразмерных частиц серебра, цинка и титана диоксида в экспериментах in vivo и in vitro, свидетельствуют о высокой чувствительности таких альтернативных моделей, как фотобактерии

«Эколюм», сперма КРС и сосуды ХАО куриного эмбриона и возможности их использования для скрининговой оценки токсичности наноразмерных частиц.

<< | >>
Источник: Гуськова Оксана Альбертовна. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ЭКСПРЕСС-МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ ТОКСИЧЕСКИХ СВОЙСТВ НАНОМАТЕРИАЛОВ. ДИССЕРТАЦИЯ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА МЕДИЦИНСКИХ НАУК. Москва - 2014.

Еще по теме ЗАКЛЮЧЕНИЕ:

  1. ВИЧ-инфекция среди заключенных пенитенциарной системы.
  2. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
  3. Заключение
  4. Вирусные гепатиты у ВИЧ-инфицнроваииых заключенных.
  5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
  6. Заключение
  7. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
  8. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
  9. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
  10. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
  11. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
  12. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
  13. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
  14. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
  15. Заключение