<<
>>

Глава 12. ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ

Лабораторная диагностика вирусных инфекций склады­вается из 3 методических направлений.

1. Обнаружение возбудителя или его компонентов не­посредственно в клиническом материале, взятом от боль­ного (быстрая диагностика).

2. Выделение вируса из клинического материала и его идентификации.

3. Серодиагностика вирусных инфекций.

Методы лабораторной диагностики вирусных инфекций основаны на использовании биологических свойств виру­сов. Так, в РГА гемагглютинины вирусов связываются с рецепторами чувствительных эритроцитов, вызывая их агглютинацию (склеивание); РГадс основана на прикре-, плении эритроцитов к участкам поверхности инфициро­ванных клеток, где локализованы гемагглютинины. Ряд методов связан с ЦПД вируса на клеточную культуру. Однако большинство тестов диагностической вирусоло­гии — это иммунологические реакции, основанные на вза­имодействии вирусных антигенов и гомологичных антител.

Выбор метода лабораторной диагностики определяется в основном характером заболевания и предполагаемым возбудителем и решается в каждом отдельном случае в зависимости от периода болезни и условий лаборатории. Общие принципы лабораторной диагностики вирусных ин­фекций приведены в табл. 16.

991

БЫСТРАЯ ДИАГНОСТИКА ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ

Быстрая диагностика позволяет обнаружить вирус или его компоненты непосредственно в пробах, взятых от больного, и дать ответ через несколько часов. Методы быстрой диагностики приведены в табл. 17. Они могут быть основаны на прямом микроскопическом ис­следовании мазков-отпечатков пораженной ткани с целью выявления внутриклеточных телец-включений; например, при бешенстве, герпетической инфекции, ветряной оспе и др.

Возбудитель может быть выявлен в пораженной ткани с помощью флюоресцирующих антител: в клетках эпи­телия слизистой оболочки верхних дыхательных путей больных респираторными инфекциями; спущенных клет­ках эпителия слизистой оболочки кишечника больных гастроэнтеритами; мазках-отпечатках, взятых из поражен­ных органов (табл. 18).

Таблица 18. Диагностика вирусных инфекций с помощью метода иммунофлюоресценции

Инфекция Быстрая диагностика при прямом исследо­вании клинического материала Культура клеток для ускоренной индикации и идентификации ви­руса после выделе- . ния из клинического материала
Грипп Десквамативный эпите- Культуры клеток по-
лий слизистой оболочки чек обезьян, эмбрио-
носоглотки; кусочки лег- на человека, МДСК
ких и трахеи, получен­ные при аутопсии и др.
Парагрипп Культуры клеток по-
чек обезьян, эмбрио­на человека Нер-2
Аденовирусная » HeLa, Нер-2, KB и др.
Респираторно-синци- Нер-2, HeLa, диплоид-
тиальная * ные клетки человека
Корь Эпителиальные клетки в осадке мочи, отделяе­мое носоглотки, лейко­циты крови, биопсийные препараты мозга, сек­ционные препараты мозговой ткани
Краснуха Культуры клеток по­чек кролика, обезьян, и др.

Инфекция Быстрая диагностика при прямом исследо­вании клинического материала Культура клеток для ускоренной индикации и идентификации ви­руса после выделе­ния из клинического материала
Энтеровирусная Секционные препараты миокарда (Коксаки),

эпителиальные клетки в осадке мочи

Культуры клеток по­чек обезьян
Паротит Культуры клеток по­чек обезьян, амнио­на человека, куриные фибробласты
Бешенство Кусочки мозга, взятые при биопсии Мазки-отпечатки моз­га и слюнных желез инфицированных мышей
Герпес Мазки из содержимого везикул, соскоба вези­кул и роговицы, секци­онные и биопсийные препараты мозговой ткани Диплоидные клетки

человека, фиброблас­ты, срезы ткани моз­га зараженных мы­шей

Цитомегалия Лейкоциты крови Диплоидные клетки

легких эмбриона че­ловека

Ветряная оспа Мазки из содержимого везикул Диплоидные клетки

легких эмбриона че­ловека

Оспа натуральная Соскобы с макул и папул, мазки из содержимого везикул Культуры клеток эпи­телиального проис­хождения
Арбовирусные Лейкоциты крови (при денге, колорадской ли­хорадке) Культуры клеток эмб­риона кур, почек, эм­бриона свиньи, BHK- 21, СПЭВ, препараты слюнных желез пе­реносчиков, гемолим­фа клещей
Гепатит В Биопсийные и секцион­ные препараты печени

,Возбудитель обнаруживают с помощью ЭМ клиничес­кого материала при негативном контрастировании.

Этот метод требует достаточно высокой концентрации возбуди­теля в пораженной ткани (IO4—IO5частиц в 1 мл сус­пензии; большие концентрации вируса бывают в фекалиях лишь при ротавирусной инфекции). Большое значение

приобретает метод ИЭМ, основанный на взаимодействии добавленных к материалу антител с вирусными части­цами, что позволяет выявить возбудитель и его одновре­менно идентифицировать, Этот метод широко применя­ется для быстрой диагностики герпетических, ротавирус­ных инфекций, гепатита А и др.

Твердофазный иммунологический анализ. Другим способом является обнаружение антигена в клиническом материале с помощью серологических реакций на твер­дой основе. Твердофазный иммунологический анализ основан на прикреплении одного из компонентов реакции (антитела или антигена) к нерастворимому твердому носителю и последовательному добавлению других ком­понентов реакции в жидкой фазе. C помощью промы­вания можно легко отделить образующийся комплекс ан­тиген — антитело от несвязывающихся компонентов. В зависимости от маркера, используемого для метки антигена или антитела, реакции твердофазного анализа могут быть двух категорий: с использованием радио­активных маркеров (РИА) и ферментов (ИФА). Эти ме­тоды являются высокочувствительными, быстрыми, C высокой воспроизводимостью результатов, а ИФА явля­ется технически простым и доступним методом. Оба метода широко применяются для быстрой диагностики гепатита А и В, гастроэнтеритов (в первую очередь ротавирусных инфекций), респираторных инфекций. Первый этап реакции — сорбция антигена или антитела на твердый носитель, которым являются панели, шарики или пробирки из синтетических инертных материалов: полистирола, дакрила, метакрилата, поливинилхлорида. Применяется несколько вариантов метода: прямой, непрямой и конкурентный (рис. 36). В прямом варианте на твердой фазе сорбируют специфические антитела, после удаления избытка антител’ добавляют материал, содержащий антиген, после отмывания несвязавшегося антигена вносят иммуноглобулин, меченный пероксидазой или щелочной фосфатазой в случае ИФА или радио­активным йодом в случае РИА.

После отмывания избытка антител в случае ИФА добавляют субстрат для фер­мента. В непрямом варианте имеется дополнительный этап — введение меченых антивидовых антител против глобулинов иммунизированных животных. Непрямой метод более чувствителен, чем прямой, и позволяет вы­являть различные вирусные антигены при использовании одной антивидовой меченой сыворотки. Конкурентный

Рис. 36. Твердофазный иммуноферментный и радиоиммунный методы (схема).

а — прямой метод (метод двойных антител); б — непрямой метод (метод тройных антител); в — конкурентный метод при сорбции антитела; г — конкурентный метод при сорбции антигена; звездочкой обозначено меченое антитело или меченый антиген.

метод основан на конкуренции известного и исследуемого антигенов за участки связывания с антителом. Метод может быть поставлен в двух вариантах — при сорбции на твердой фазе антитела или антигена. В первом вари­анте к антителам, сорбированным на твердой фазе, до­бавляют исследуемый антиген, а затем известный анти­ген, меченный ферментом. В том случае, если исследуемый антиген связался с антитезами, связывание меченого антигена будет ограничено. В другом варианте сорбируют известный антиген, затем добавляют специфический немеченый иммуноглобулин и исследуемый антиген либо заранее проинкубированную смесь антигена и иммуно­глобулина, после этого добавляют антивидовые меченые антитела и затем субстрат. Преимуществом конкурентного метода является его чрезвычайно высокая чувствитель­ность и специфичность реакции. При этом методе ис­пользуют в качестве известного антигена очищенные вирусные белки. Результаты ИФА определяют визуально или с помощью специального усройства (ридера), ре­зультаты РИА — с помощью счетчика или авторадио­графии, используя рентгеновскую пленку.

Молекулярная гибридизация (МГ). Методы МГ ши­роко используются для анализа вирусных ДНК и PHK и их взаимодействий. В настоящее время эти методы стали применять для диагностики вирусных инфекций. Их использование все более расширяется в связи с тем, что они позволяют обнаружить единичные копии генов в клеточной популяции и по степени чувствительности не имеют себе равных среди других диагностических методов.

В первую очередь методы МГ применяют для вы­явления персистирующих вирусов и вирусов, находящихся в клиническом материале (крови, моче, смывах носоглот­ки, фекалиях и т. д.), которые не размножаются в куль­туре клеток. Эти методы относительно просты и позволяют быстро поставить диагноз, однако их недостатком явля­ется необходимость использования чистых реактивов, которые готовят специализированные лаборатории.

Реакция МГ основана на гибридизации комплемен­тарных нитей ДНК или PHK и формировании двунит­чатых структур. Гибридизация может протекать между комплементарными молекулами ДНК-ДНК, ДНК-РНК и РНК-РНК. Приготовление зонда. Зондом называют ДНК или РНК, с помощью которых выявляют наличие в материале комплементарных нитей. Зонд можно приготовить из нуклеиновой кислоты, выделенной из вирионов; можно использовать иРНК, полученные при транскрипции in vitro (таким путем, например, получают зонд для ротавирусов). Однако наиболее дешевым зон­дом является клонированная рекомбинатная ДНК. Клонированные зонды получены для определения боль­шинства патогенных для человека вирусов. Зонд метят радиоактивными предшественниками (обычно радио­активным фосфором) в реакции, которая называется «ник трансляция». Эта реакция основана на разрывах нити ДНК эндонуклеазой и одновременного ковалентного присоединения к концам разрывов с помощью концевой нуклеотидилтрансферазы нуклеотидов, меченных радио­активным фосфором. Недостатком этого метода явля­ется короткий период полураспада радиоактивного фосфора и необходимость в специальном оборудовании для определения радиоактивности. Поэтому перспективно использование колориметрических реакций. C этой целью в молекулу зонда при «ник трансляции» вводят биотин, который способен прочно связывать авидин или стреп- товиридин, в свою очередь связанные с ферментом

(пероксидаза или щелочная фосфатаза). При добавлении субстрата к такому зонду возникает 'окраска, видимая невооруженным глазом.

Точечная гибридизация позволяет одно­моментно исследовать большое количество клинических проб. На стандартные фильтры наносят выделенную из проб ДНК или РНК; при наличии возможных дву­нитчатых структур их денатурируют и затем добавляют зонд. Метод используют для выявления вируса цитоме­галии, вируса гепатита В, ротавирусов, энтеровирусов, парвовирусов, вирусов герпеса, гриппа и др.

Блот-гибридизация (от англ, blot — пятно) по Саузерну — метод выявления фрагментов ДНК, раз­деленных путем электрофореза в агарозе. Выделенную из ткани и очищенную ДНК нарезают на фрагменты рестрикционными эндонуклеазами и после электрофореза фрагменты переносят с агарозы на нитроцеллюлозные фильтры, на которые наносят меченый зонд. Этим мето­дом определяют количество вирусспецифических после­довательностей в выделенных из клеток ДНК. Метод применяют для обнаружения в опухолевой ткани геномов вируса Эпстайна — Барр, папилломавирусов и др. Анало­гичный метод «северный блоттинг» можно использовать для обнаружения фрагментов РНК, однако он мало используется в диагностической вирусологии.

«Сэндвич»- гибридизация основана на исполь­зовании двух клонированных неидентичных фрагментов ДНК, один из которых иммобилизован на фильтре, а другой является зондом. Присутствующая в пробе комп­лементарная нить гибридизуется с обеими нитями ДНК и связывает зонд с фильтром. Метод обладает высокой чувствительностью и позволяет использовать пробы без предварительной обработки. Используется для обнару­жения аденовирусов в отделяемом носоглотки, вируса ци­томегалии в моче и т. д. Возможен другой вариант метода, при котором зонд гибридизуется с известной иммобилизованной на фильтре ДНК и связывает ДНК, находящуюся в пробе. Такой метод несколько проигры­вает в чувствительности, но выигрывает в скорости гибридизации.

Гибридизация in situ применяется для выявления вирусных ДНК и PHK в индивидуальных клетках, а также персистирующих вирусов (например, в случае нейроинфекций). Используют замороженные срезы ткани, полученной при биопсии, и другие материалы. Таким обра­

зом существует несколько вариантов метода: гибридизация на фильтрах, точечная гибридизация, блот-гибридиза- ция, «сэндвич»-гибридизация, гибридизация in situ, прямая гибридизация в геле и др.

<< | >>
Источник: Букринская А.Г.. Вирусология.— M.: Медицина, 1986 г. 336 с.. 1986

Еще по теме Глава 12. ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ:

  1. Приложение 3 Инструкция по проведению этиологической лабораторной диагностики коронавирусной инфекции
  2. Лекция 22 Общая вирусология. Принципы диагностики, специфической профилактики и терапии вирусных инфекций. Противовирусный иммунитет.
  3. Глава 8. ПАТОГЕНЕЗ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ
  4. Глава V. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ЛАБОРАТОРНО-ИНСТРУМЕНТАЛЬНАЯ И МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СОСТОЯНИЯ ПЕЧЕНИ У ПАЦИЕНТОВ С АРТЕРИАЛЬНОЙ ГИПЕРТЕНЗИЕЙ В СОЧЕТАНИИ С ХРОНИЧЕСКИМ ВИРУСНЫМ ГЕПАТИТОМ С И НЕАЛКОГОЛЬНЫМ СТЕАТОГЕПАТИТОМ
  5. Глава 11. ХИМИОТЕРАПИЯ И ИММУНОПРОФИЛАКТИКА ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ
  6. Глава 6 СОВРЕМЕННЫЕ ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ ПРОФИЛАКТИКИ ТРАНСФУЗИОННЫХ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ
  7. Глава 10. ЭКОЛОГИЯ ВИРУСОВ И ЭПИДЕМИОЛОГИЯ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ
  8. Глава 3 СРАВНИТЕЛЬНАЯ ПАТОГЕНЕТИЧЕСКАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКИ ТРАНСФУЗИОННЫХ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ
  9. Глава 2 ФОРМИРОВАНИЕ И РАЗВИТИЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЙ О ТРАИСФУЗИОИИЫХ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЯХ И ИХ ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОМ СВОЕОБРАЗИИ
  10. Глава 5 ГРУППЫ С ВЫСОКИМ РИСКОМ ИНФИЦИРОВАНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯМИ ТРАНСФУЗИОННЫХ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ И ИХ ЗНАЧЕНИЕ
  11. Глава 1 ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ СОВРЕМЕННОГО УЧЕНИЯ ОБ ЭПИДЕМИЧЕСКОМ ПРОЦЕССЕ И ПРОФИЛАКТИКЕ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ
  12. Глава 4 ХАРАКТЕРИСТИКА И ОСОБЕННОСТИ ЭПИДЕМИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА ПРИ ТРАИСФУЗИОИИЫХ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЯХ, КАК ОСНОВА СВОЕОБРАЗИЯ ИХ ЭПИДЕМИОЛОГИИ
  13. Современная лабораторная диагностика ВУИ в практическом здравоохранении. Критерии диагностики ВУИ