Глава 12. ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ
Лабораторная диагностика вирусных инфекций складывается из 3 методических направлений.
1. Обнаружение возбудителя или его компонентов непосредственно в клиническом материале, взятом от больного (быстрая диагностика).
2. Выделение вируса из клинического материала и его идентификации.
3. Серодиагностика вирусных инфекций.
Методы лабораторной диагностики вирусных инфекций основаны на использовании биологических свойств вирусов. Так, в РГА гемагглютинины вирусов связываются с рецепторами чувствительных эритроцитов, вызывая их агглютинацию (склеивание); РГадс основана на прикре-, плении эритроцитов к участкам поверхности инфицированных клеток, где локализованы гемагглютинины. Ряд методов связан с ЦПД вируса на клеточную культуру. Однако большинство тестов диагностической вирусологии — это иммунологические реакции, основанные на взаимодействии вирусных антигенов и гомологичных антител.
Выбор метода лабораторной диагностики определяется в основном характером заболевания и предполагаемым возбудителем и решается в каждом отдельном случае в зависимости от периода болезни и условий лаборатории. Общие принципы лабораторной диагностики вирусных инфекций приведены в табл. 16.
991
БЫСТРАЯ ДИАГНОСТИКА ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ
Быстрая диагностика позволяет обнаружить вирус или его компоненты непосредственно в пробах, взятых от больного, и дать ответ через несколько часов. Методы быстрой диагностики приведены в табл. 17. Они могут быть основаны на прямом микроскопическом исследовании мазков-отпечатков пораженной ткани с целью выявления внутриклеточных телец-включений; например, при бешенстве, герпетической инфекции, ветряной оспе и др.
Возбудитель может быть выявлен в пораженной ткани с помощью флюоресцирующих антител: в клетках эпителия слизистой оболочки верхних дыхательных путей больных респираторными инфекциями; спущенных клетках эпителия слизистой оболочки кишечника больных гастроэнтеритами; мазках-отпечатках, взятых из пораженных органов (табл. 18).
Таблица 18. Диагностика вирусных инфекций с помощью метода иммунофлюоресценции
Инфекция | Быстрая диагностика при прямом исследовании клинического материала | Культура клеток для ускоренной индикации и идентификации вируса после выделе- . ния из клинического материала |
Грипп | Десквамативный эпите- | Культуры клеток по- |
лий слизистой оболочки | чек обезьян, эмбрио- | |
носоглотки; кусочки лег- | на человека, МДСК | |
ких и трахеи, полученные при аутопсии | и др. | |
Парагрипп | Культуры клеток по- | |
чек обезьян, эмбриона человека Нер-2 | ||
Аденовирусная | » | HeLa, Нер-2, KB и др. |
Респираторно-синци- | Нер-2, HeLa, диплоид- | |
тиальная | * | ные клетки человека |
Корь | Эпителиальные клетки в осадке мочи, отделяемое носоглотки, лейкоциты крови, биопсийные препараты мозга, секционные препараты мозговой ткани | |
Краснуха | Культуры клеток почек кролика, обезьян, и др. |
Инфекция | Быстрая диагностика при прямом исследовании клинического материала | Культура клеток для ускоренной индикации и идентификации вируса после выделения из клинического материала |
Энтеровирусная | Секционные препараты миокарда (Коксаки), эпителиальные клетки в осадке мочи | Культуры клеток почек обезьян |
Паротит | Культуры клеток почек обезьян, амниона человека, куриные фибробласты | |
Бешенство | Кусочки мозга, взятые при биопсии | Мазки-отпечатки мозга и слюнных желез инфицированных мышей |
Герпес | Мазки из содержимого везикул, соскоба везикул и роговицы, секционные и биопсийные препараты мозговой ткани | Диплоидные клетки человека, фибробласты, срезы ткани мозга зараженных мышей |
Цитомегалия | Лейкоциты крови | Диплоидные клетки легких эмбриона человека |
Ветряная оспа | Мазки из содержимого везикул | Диплоидные клетки легких эмбриона человека |
Оспа натуральная | Соскобы с макул и папул, мазки из содержимого везикул | Культуры клеток эпителиального происхождения |
Арбовирусные | Лейкоциты крови (при денге, колорадской лихорадке) | Культуры клеток эмбриона кур, почек, эмбриона свиньи, BHK- 21, СПЭВ, препараты слюнных желез переносчиков, гемолимфа клещей |
Гепатит В | Биопсийные и секционные препараты печени |
,Возбудитель обнаруживают с помощью ЭМ клинического материала при негативном контрастировании.
Этот метод требует достаточно высокой концентрации возбудителя в пораженной ткани (IO4—IO5частиц в 1 мл суспензии; большие концентрации вируса бывают в фекалиях лишь при ротавирусной инфекции). Большое значениеприобретает метод ИЭМ, основанный на взаимодействии добавленных к материалу антител с вирусными частицами, что позволяет выявить возбудитель и его одновременно идентифицировать, Этот метод широко применяется для быстрой диагностики герпетических, ротавирусных инфекций, гепатита А и др.
Твердофазный иммунологический анализ. Другим способом является обнаружение антигена в клиническом материале с помощью серологических реакций на твердой основе. Твердофазный иммунологический анализ основан на прикреплении одного из компонентов реакции (антитела или антигена) к нерастворимому твердому носителю и последовательному добавлению других компонентов реакции в жидкой фазе. C помощью промывания можно легко отделить образующийся комплекс антиген — антитело от несвязывающихся компонентов. В зависимости от маркера, используемого для метки антигена или антитела, реакции твердофазного анализа могут быть двух категорий: с использованием радиоактивных маркеров (РИА) и ферментов (ИФА). Эти методы являются высокочувствительными, быстрыми, C высокой воспроизводимостью результатов, а ИФА является технически простым и доступним методом. Оба метода широко применяются для быстрой диагностики гепатита А и В, гастроэнтеритов (в первую очередь ротавирусных инфекций), респираторных инфекций. Первый этап реакции — сорбция антигена или антитела на твердый носитель, которым являются панели, шарики или пробирки из синтетических инертных материалов: полистирола, дакрила, метакрилата, поливинилхлорида. Применяется несколько вариантов метода: прямой, непрямой и конкурентный (рис. 36). В прямом варианте на твердой фазе сорбируют специфические антитела, после удаления избытка антител’ добавляют материал, содержащий антиген, после отмывания несвязавшегося антигена вносят иммуноглобулин, меченный пероксидазой или щелочной фосфатазой в случае ИФА или радиоактивным йодом в случае РИА.
После отмывания избытка антител в случае ИФА добавляют субстрат для фермента. В непрямом варианте имеется дополнительный этап — введение меченых антивидовых антител против глобулинов иммунизированных животных. Непрямой метод более чувствителен, чем прямой, и позволяет выявлять различные вирусные антигены при использовании одной антивидовой меченой сыворотки. Конкурентный
Рис. 36. Твердофазный иммуноферментный и радиоиммунный методы (схема).
а — прямой метод (метод двойных антител); б — непрямой метод (метод тройных антител); в — конкурентный метод при сорбции антитела; г — конкурентный метод при сорбции антигена; звездочкой обозначено меченое антитело или меченый антиген.
метод основан на конкуренции известного и исследуемого антигенов за участки связывания с антителом. Метод может быть поставлен в двух вариантах — при сорбции на твердой фазе антитела или антигена. В первом варианте к антителам, сорбированным на твердой фазе, добавляют исследуемый антиген, а затем известный антиген, меченный ферментом. В том случае, если исследуемый антиген связался с антитезами, связывание меченого антигена будет ограничено. В другом варианте сорбируют известный антиген, затем добавляют специфический немеченый иммуноглобулин и исследуемый антиген либо заранее проинкубированную смесь антигена и иммуноглобулина, после этого добавляют антивидовые меченые антитела и затем субстрат. Преимуществом конкурентного метода является его чрезвычайно высокая чувствительность и специфичность реакции. При этом методе используют в качестве известного антигена очищенные вирусные белки. Результаты ИФА определяют визуально или с помощью специального усройства (ридера), результаты РИА — с помощью счетчика или авторадиографии, используя рентгеновскую пленку.
Молекулярная гибридизация (МГ). Методы МГ широко используются для анализа вирусных ДНК и PHK и их взаимодействий. В настоящее время эти методы стали применять для диагностики вирусных инфекций. Их использование все более расширяется в связи с тем, что они позволяют обнаружить единичные копии генов в клеточной популяции и по степени чувствительности не имеют себе равных среди других диагностических методов.
В первую очередь методы МГ применяют для выявления персистирующих вирусов и вирусов, находящихся в клиническом материале (крови, моче, смывах носоглотки, фекалиях и т. д.), которые не размножаются в культуре клеток. Эти методы относительно просты и позволяют быстро поставить диагноз, однако их недостатком является необходимость использования чистых реактивов, которые готовят специализированные лаборатории.
Реакция МГ основана на гибридизации комплементарных нитей ДНК или PHK и формировании двунитчатых структур. Гибридизация может протекать между комплементарными молекулами ДНК-ДНК, ДНК-РНК и РНК-РНК. Приготовление зонда. Зондом называют ДНК или РНК, с помощью которых выявляют наличие в материале комплементарных нитей. Зонд можно приготовить из нуклеиновой кислоты, выделенной из вирионов; можно использовать иРНК, полученные при транскрипции in vitro (таким путем, например, получают зонд для ротавирусов). Однако наиболее дешевым зондом является клонированная рекомбинатная ДНК. Клонированные зонды получены для определения большинства патогенных для человека вирусов. Зонд метят радиоактивными предшественниками (обычно радиоактивным фосфором) в реакции, которая называется «ник трансляция». Эта реакция основана на разрывах нити ДНК эндонуклеазой и одновременного ковалентного присоединения к концам разрывов с помощью концевой нуклеотидилтрансферазы нуклеотидов, меченных радиоактивным фосфором. Недостатком этого метода является короткий период полураспада радиоактивного фосфора и необходимость в специальном оборудовании для определения радиоактивности. Поэтому перспективно использование колориметрических реакций. C этой целью в молекулу зонда при «ник трансляции» вводят биотин, который способен прочно связывать авидин или стреп- товиридин, в свою очередь связанные с ферментом
(пероксидаза или щелочная фосфатаза). При добавлении субстрата к такому зонду возникает 'окраска, видимая невооруженным глазом.
Точечная гибридизация позволяет одномоментно исследовать большое количество клинических проб. На стандартные фильтры наносят выделенную из проб ДНК или РНК; при наличии возможных двунитчатых структур их денатурируют и затем добавляют зонд. Метод используют для выявления вируса цитомегалии, вируса гепатита В, ротавирусов, энтеровирусов, парвовирусов, вирусов герпеса, гриппа и др.
Блот-гибридизация (от англ, blot — пятно) по Саузерну — метод выявления фрагментов ДНК, разделенных путем электрофореза в агарозе. Выделенную из ткани и очищенную ДНК нарезают на фрагменты рестрикционными эндонуклеазами и после электрофореза фрагменты переносят с агарозы на нитроцеллюлозные фильтры, на которые наносят меченый зонд. Этим методом определяют количество вирусспецифических последовательностей в выделенных из клеток ДНК. Метод применяют для обнаружения в опухолевой ткани геномов вируса Эпстайна — Барр, папилломавирусов и др. Аналогичный метод «северный блоттинг» можно использовать для обнаружения фрагментов РНК, однако он мало используется в диагностической вирусологии.
«Сэндвич»- гибридизация основана на использовании двух клонированных неидентичных фрагментов ДНК, один из которых иммобилизован на фильтре, а другой является зондом. Присутствующая в пробе комплементарная нить гибридизуется с обеими нитями ДНК и связывает зонд с фильтром. Метод обладает высокой чувствительностью и позволяет использовать пробы без предварительной обработки. Используется для обнаружения аденовирусов в отделяемом носоглотки, вируса цитомегалии в моче и т. д. Возможен другой вариант метода, при котором зонд гибридизуется с известной иммобилизованной на фильтре ДНК и связывает ДНК, находящуюся в пробе. Такой метод несколько проигрывает в чувствительности, но выигрывает в скорости гибридизации.
Гибридизация in situ применяется для выявления вирусных ДНК и PHK в индивидуальных клетках, а также персистирующих вирусов (например, в случае нейроинфекций). Используют замороженные срезы ткани, полученной при биопсии, и другие материалы. Таким обра
зом существует несколько вариантов метода: гибридизация на фильтрах, точечная гибридизация, блот-гибридиза- ция, «сэндвич»-гибридизация, гибридизация in situ, прямая гибридизация в геле и др.
Еще по теме Глава 12. ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ:
- Приложение 3 Инструкция по проведению этиологической лабораторной диагностики коронавирусной инфекции
- Лекция 22 Общая вирусология. Принципы диагностики, специфической профилактики и терапии вирусных инфекций. Противовирусный иммунитет.
- Глава 8. ПАТОГЕНЕЗ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ
- Глава V. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ЛАБОРАТОРНО-ИНСТРУМЕНТАЛЬНАЯ И МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СОСТОЯНИЯ ПЕЧЕНИ У ПАЦИЕНТОВ С АРТЕРИАЛЬНОЙ ГИПЕРТЕНЗИЕЙ В СОЧЕТАНИИ С ХРОНИЧЕСКИМ ВИРУСНЫМ ГЕПАТИТОМ С И НЕАЛКОГОЛЬНЫМ СТЕАТОГЕПАТИТОМ
- Глава 11. ХИМИОТЕРАПИЯ И ИММУНОПРОФИЛАКТИКА ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ
- Глава 6 СОВРЕМЕННЫЕ ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ ПРОФИЛАКТИКИ ТРАНСФУЗИОННЫХ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ
- Глава 10. ЭКОЛОГИЯ ВИРУСОВ И ЭПИДЕМИОЛОГИЯ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ
- Глава 3 СРАВНИТЕЛЬНАЯ ПАТОГЕНЕТИЧЕСКАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКИ ТРАНСФУЗИОННЫХ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ
- Глава 2 ФОРМИРОВАНИЕ И РАЗВИТИЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЙ О ТРАИСФУЗИОИИЫХ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЯХ И ИХ ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОМ СВОЕОБРАЗИИ
- Глава 5 ГРУППЫ С ВЫСОКИМ РИСКОМ ИНФИЦИРОВАНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯМИ ТРАНСФУЗИОННЫХ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ И ИХ ЗНАЧЕНИЕ
- Глава 1 ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ СОВРЕМЕННОГО УЧЕНИЯ ОБ ЭПИДЕМИЧЕСКОМ ПРОЦЕССЕ И ПРОФИЛАКТИКЕ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ
- Глава 4 ХАРАКТЕРИСТИКА И ОСОБЕННОСТИ ЭПИДЕМИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА ПРИ ТРАИСФУЗИОИИЫХ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЯХ, КАК ОСНОВА СВОЕОБРАЗИЯ ИХ ЭПИДЕМИОЛОГИИ
- Современная лабораторная диагностика ВУИ в практическом здравоохранении. Критерии диагностики ВУИ