<<
>>

Применение метода ПЦР для диагностики ВУИ

В последние годы основным способом этиологической верификации ВУИ является ПЦР. Многочисленные исследования подтвердили достоверность результатов ПЦР при поиске возбудителей ВУИ.

Преимуществами метода ПЦР являются:

- высокая информативность, диагностическая чувствительность и специфичность метода - близки к 100% (способность выявлять типичные нуклеотидные последовательности конкретного инфекционного агента в низкой концентрации и в присутствии других микроорганизмов, отсутствие перекрестных реакций со сходными микроорганизмами, способность выявлять ДНК конкретного инфекционного агента в присутствии ДНК других микроорганизмов и ДНК организма-хозяина), что позволяет проводить своевременное этиопатогенетическое лечение;

- позволяет выявлять сочетанные инфекции (обнаружить несколько возбудителей в одной пробе);

- возможность диагностики инфекционных болезней на самых ранних стадиях заболевания; возможность раннего обнаружения возбудителя в организме пациента еще до начала формирования иммунного ответа; и на протяжении всего как острого, так и хронического процесса;

- детекция возбудителей, которые не культивируются или трудно культивируются;

- детекция инфекционных агентов как при манифестных формах инфекции, так и при латентных и бессимптомных формах инфекционного процесса; позволяет отслеживать персистенцию возбудителей в организме;

- возможность количественной оценки результатов исследования и генотипирования;

- обнаружение возбудителя в любом биологическом материале организма и объектах окружающей среды;

- возможность транспортировки и длительного хранения проб, заморозки проб; не требует сохранения жизнеспособности возбудителя;

- быстрота выполнения анализа и высокая производительность; минимальный объем проб и реактивов; возможность автоматизации процесса исследования, компьютеризации и проведения контроля качества на разных этапах исследования;

- возможность проведения массовых скрининговых исследований.

Диагностическое значение ПЦР существенно повышается, если используются методики ПЦР с количественным определением, позволяющие оценить «антигенную нагрузку», а также при исследовании нескольких биологических сред.

Материалом для исследования методом ПЦР может служить любая биологическая среда организма (кровь, в том числе пуповинная, ликвор, слюна, моча, соскобы и мазки со слизистых, в том числе из трахеи, ротоглотки, с конъюнктивы, из уретры, слезная жидкость, содержимое везикул, биоптаты органов и тканей и др.). Абсолютным критерием верификации диагноза «врожденная ЦМВИ и ВПГИ» является выявление вирусемии, антигенемии или ДНК-емии, а при поражении ЦНС - в ликворе, которые достоверно указывают на клинически значимую активность репликации ЦМВ и ВПГ. При ЦМВИ наиболее информативным является определение ДНК ЦМВ в моче и слюне. Дети с врожденной ЦМВИ

в первые дни жизни и далее многие месяцы (до 2-4 лет) продолжают выделять ЦMВ с мочой и слюной.

Причинами ложноотрицательных, ложноположительных результатов и слабоположительных результатов (примерно 10%) при исследованиях методом ПЦР могут быть:

- недостаточный выбор стандартизированных коммерческих тест- систем

- жесткие санитарно-гигиенические требования к помещениям и организации производственного процесса в ПЦР-лаборатории

- большая зависимость результата от строгого соблюдения всей технологии, начиная от правильного забора материала, качества транспортной среды и условий транспортировки и хранения образцов

При оценке результатов ПЦР-исследований необходимо учитывать:

1) Обнаружение методом ПЦР в анализируемом объекте генетического материала возбудителя (ДНК, РНК) не всегда свидетельствует об активной инфекции, может служить лишь свидетельством инфицирования (или носительства), но не признаком конкретного инфекционного заболевания; не являются безусловным доказательством этиологической значимости выявленного возбудителя в патологическом процессе. Поэтому однократного обследования недостаточно для постановки диагноза острой инфекционной болезни.

2) Изолированное использование одного молекулярно-биологического метода (например, качественной ПЦР для диагностики ЦMВИ) может привести к гипердиагностике. Выявление минимальных количеств возбудителя в тканях и жидкостях новорожденного не может служить достоверным основанием для постановки диагноза соответствующей инфекции, ни для назначения этиотропного лечения, особенно современными цитотоксичными противовирусными препаратами.

Следует учитывать, что в 27% случаев в ПЦР выявляется ДНК ЦMВ, находящегося в латентном состоянии, что весьма затрудняет интерпретацию полученных данных. Выделение ДНК ЦMВ в биосубстрате свидетельствует о репликации вируса в организме, но не является абсолютным критерием заболевания. Должно быть комплексное обследование: идентификация возбудителя в различных биологических средах организма (кровь, ликвор, моча, слюна, мазки из половых органов, мокрота) и дополнительные методы исследования (определение специфических антител методом ИФА).

3) Однократное выявление ЦMВ или его генома в материале (в крови и/или моче) не обязательно свидетельствует об активной (врожденной) инфекции. Это может быть признаком транзиторной перинатальной вирусемии. Вместе с тем, отрицательный результат обследования методом ПЦР, полученный в первые дни жизни, не исключает возможности отсроченной реализации внутриутробной ЦMВИ. Отсутствие в крови на

момент рождения ДНК ЦМВ не всегда свидетельствует об отсутствии ВУИ и требует динамического обследования детей из группы риска.

4) Выявление в пуповинной крови ДНК ЦМВ при отсутствии клинических проявлений инфекции свидетельствует об инфицированности ребенка и требует динамического обследования. Инфицирование на момент рождения сопровождается клиническим проявлениями ЦМВИ при количестве копий ДНК в пуповинной крови 10 в 5 ст копий/мл. Отсутствие ДНК ЦМВ в биологических жидкостях ребенка на первой неделе жизни не исключают его инфицирования или развития у него острой ЦМВИ в последующем.

5) Доказательством ВУИ является выделение ЦМВ или ЦМВ-антигена в первые 2-4 недели жизни. Первое выявление ЦМВ в материале, полученном позже трех- или четырехнедельного возраста, может отражать как врожденную, так и постнатальную инфекцию (обнаружение герпес­вирусов прямыми лабораторными методами у ребенка в течение первых 3-х недель жизни свидетельствует о внутриутробной передаче вируса от матери к ребенку).

Возможно, выявление ЦМВ у части детей через 1-3 месяца является отсроченным проявлением ВУИ бессимптомной ЦМВИ. Не исключено также, что инфицирование этих новорожденных ЦМВ произошло уже в неонатальном периоде, в частности, при гемотрансфузиях или при вскармливании младенцев инфицированным грудным молоком.

6) Положительный результат ПЦР свидетельствует только о наличии вируса герпеса в организме человека, но не позволяет отличить носительство от активно протекающей инфекции. Отрицательный результат ПЦР не позволяет исключить герпетическую инфекцию, так как из-за короткого репродуктивного цикла возбудителя (в эпителиальных клетках составляет всего 20 ч) материал для исследования может быть взят слишком рано или поздно. В 25-35% клинически выраженных форм герпес-вирусных инфекций ПЦР может давать отрицательные результаты.

7) Предпочтительным объектом скринингового исследования для диагностики внутриутробной ЦМВИ является моча, в которой вирус накапливается чаще всего и в больших количествах, чем в других клинических материалах (слюна, кровь, ликвор). Эти данные согласуются с результатами многих исследователей, которые показали, что в моче ЦМВ обнаруживается в количествах в 180 раз больших, чем в крови. На основании этих данных диагностика ВУИ ЦМВ в медицинских центрах европейских стран проводится путем изучения мочи БКМ.

8) При обследовании практически здоровых детей на 1 -й неделе жизни методом ПЦР в 8,5% случаев были выявлены ВПГ или ЦМВ (исследовали мочу, кровь, слюну, по показаниям - ликвор). Это может свидетельствовать о большей чувствительности ПЦР или об отсутствии выраженной инфекционной активности вируса, обнаруженного в материалах практически здоровых детей.

9) Обнаружение ДНК EBV в исследуемом материале указывает на этиологическую роль вируса в развитии заболевания при наличии соответствующей клинической картины. Однако из-за того, что EBV может длительно персистировать в организме пациента и, соответственно, обнаруживаться в исследуемом материале методом ПЦР, оценить его роль, а развитии заболевания не всегда возможно

10) В связи с тем, что микоплазмы и уреаплазмы относятся к условно­патогенным микроорганизмам, оценка результатов их качественного обнаружения методом ПЦР вызывает определенные трудности. Данные ПЦР без дополнительных исследований не могут служить надежной основой для диагностики уреаплазмоза.

11) Результаты исследований свидетельствуют о том, что даже при острой инфекции микоплазмы и уреаплазмы в сыворотке крови выявляются редко. Следовательно, диагностика микоплазменной и уреаплазменной инфекций не может быть основана только на выявлении их ДНК в крови с помощью ПЦР. Особого внимания заслуживает факт выявления ДНК микоплазмы и уреаплазмы в сыворотке крови клинически здоровых людей, что, по-видимому, связано с широким распространением здорового носительства этих бактерий и, возможно, их транзиторным пребыванием в крови.

12) Главным фактором, ограничивающим эффективность прямых методов выявления токсоплазм в организме человека (микроскопия, культуральный метод, ПЦР) является кратковременность пребывания возбудителей в доступных для исследования биологических жидкостях, кратковременная паразитемия.

По данным ряда ученых, исследование одиночного образца крови через 2-23 недели после заражения токсоплазмами положительно только у одной трети пациентов, а в первые 5 недель - в половине случаев доказанного заражения. Таким образом, отрицательный результат ПЦР не исключает наличие инвазии. Более того, даже в условиях референсных лабораторий в ¼ случаев наблюдаются ложноположительные результаты ПЦР, поэтому следует признать, что даже этот метод является относительно достоверным.

13) Ни один из существующих методов диагностики хламидийной инфекции не является оптимальным. Золотым стандартом является комплексный подход к диагностике хламидиоза - подтверждение наличия возбудителя двумя или тремя различными методами.

Следует обратить особое внимание на выявление ДНК C.trachomatisв образцах крови у новорожденных детей, являющееся маркером генерализации хламидийной инфекции.

14) Для получения адекватных результатов исследования важен правильный выбор объекта исследования. В большинстве случаев следует применять мультисайтовые подходы (взятие биоматериала одновременно из нескольких точек, разделенных пространственно и функционально), поскольку в крови возбудители выявляются, как правило, при генерализованных формах инфекции или синдроме выраженной иммуносупрессии.

Использование ПЦР при исследованиях сыворотки крови и мочи новорожденных не всегда позволяет выявить этиологию ВУИ, так как инфекционные патогены могут концентрироваться в тканевом компартменте. При ПЦР исследовании герпетических инфекций необходимо использовать разный биологический материал (кровь, мочу, слюну, CMM). В одном из многочисленных исследований было показано, что в связи с полиморфизмом клинических симптомов герпесвирусных инфекций высока диагностическая значимость определения геномов герпесвирусов в трех средах (кровь, слюна, моча) методом ПЦР и высоких титров G-антител (439 ед для ЦMВ и 212,3 ед для ВГЧ-6). Авторы отмечают, что по результатам проведенного исследования на ЦMВИ данные мониторинга вирусной нагрузки методом ПЦР в крови и моче свидетельствовали о лучшей выявляемости вируса в моче. Тем не менее, количество ДНК в крови лучше коррелировало с клинической картиной, что дает основание рекомендовать исследование мочи как скрининговый тест, в то время как вирусная нагрузка в крови должна учитываться при решении вопроса о назначении и длительности терапии. Данные разных исследований показали, что в моче ЦMВ обнаруживается намного чаще, чем в крови (в количествах в 180 раз больших).

Весьма перспективной составляющей клинической генодиагностики является секвенирование полученного ДНК/РНК возбудителя (ампликона), то есть определение нуклеотидных последовательностей продукта реакции и сравнение их с нуклеотиндыми последовательностями эталонных штаммов. С помощью данного метода можно определять и оценивать формирующуюся в эволюции заболевания антибактериальную или антивирусную лекарственную устойчивость, а также синдром генорезистентности в целом. Но в настоящее время для широкой практики этот метод остается недоступным. Помимо ПЦР на основании методов амплификации нуклеиновых кислот созданы разнообразные альтернативные технологии - ЛЦР (LCR - ligase chain reaction), NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification), TMA (Transcription-Mediated Amplification), SDA (Strand Displasment Amplification) и другие, с помощью которых выявляют C. trachomatis и др.

5.6.

<< | >>
Источник: Эпидемиология внутриутробных и внутрибольничных инфекций новорожденных: учебное пособие / В.В. Шкарин, Л.Ю. Послова, О.В. Ковалишена, А.В. Сергеева, Н.Е. Сенягина. - Н. Новгород, 2019.- 124 с.. 2019

Еще по теме Применение метода ПЦР для диагностики ВУИ:

  1. Применение серологического метода для диагностики ВУИ
  2. Применение метода ПЦР
  3. Результаты диагностики урогенитальных инфекций методом ПЦР
  4. Диагностика урогенитальных инфекций методом полимеразной цепной реакции (ПЦР)
  5. Современная лабораторная диагностика ВУИ в практическом здравоохранении. Критерии диагностики ВУИ
  6. Дополнительные методы диагностики ВУИ
  7. Характеристика методов диагностики ВУИ
  8. Характеристика методов диагностики ВУИ
  9. 2.5. Применение метода картографирования для обоснования системы управления медицинскими отходами
  10. Критерии диагностики ВУИ
  11. Актуальность проблемы диагностики ВУИ
  12. Общие принципы диагностики ВУИ (клинико-лабораторный мониторинг)
  13. ВОЗМОЖНОСТИ И СЛОЖНОСТИ ДИАГНОСТИКИ ВУИ
  14. Рекомендации по практическому применению специальных полимерных чехлов для защиты датчиков и одноразовых стерильных покрытий для защиты медицинского оборудования, используемого в медицинских организациях.
  15. ПОКАЗАНИЯ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ ГЕПАРИНОВ
  16. Пневмонии: клиника, диагностика, лечение и профилактика: учеб. метод. пособие для студентов 4, 5 курсов медико -диагностического факультета медицинских вузов / Д. П. Саливончик, А. И. Рудько, В. В. Рос- солова. — Гомель: ГомГМУ,2015. — 56 с., 2015