Микробиологические методы выделения возбудителей инфекционных осложнений

В ходе работы проводили исследование проб клинического материала (крови, мокроты, бронхоальвеолярной жидкости, мочи, раневого отделяемо- го, ликвора, плевральной жидкости, выпота из брюшной полости), подклю- чичных и мочевых катетеров, мазков со слизистой носовых ходов и кожи локтевого сгиба медицинского персонала и пациентов, воздуха, смывов с по-

верхностей и узлов аппаратов искусственной вентиляции легких и объектов госпитальной среды в отделении интенсивной терапии.

Организация микробиологических исследований соответствовала тре- бованиям руководства по санитарной микробиологии (2006) и методически- ми рекомендациями по микробиологической диагностике раневых инфекций в лечебно-диагностических учреждениях армии и флота (1999), утвержден- ных начальником ГВМУ МО РФ, другим нормативно-правовым документам. Она включала проведение разъяснительной работы с врачами и медицински- ми сестрами; забор проб в условиях, исключающих контаминацию; доставку проб в микробиологическую лабораторию; проведение посевов на питатель- ные среды; идентификацию и исследование чувствительности возбудителей к антибиотикам. Для исследования чувствительности возбудителей приме- няли диско-диффузионный метод. Контроль качества постановки чувстви- тельности проводили 1 раз в неделю с помощью референс-штаммов микро- организмов Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. Грамположительные кокки дифферен- цировали по наличию каталазы, грамотрицательные – цитохромоксидазы. В тот же день идентификацию возбудителей продолжали, используя набор те- стов: для стафилококков – наличие плазмокоагулазы; энтерококков – редук- ция метиленового синего; грамотрицательных палочек и кокков – способ- ность к окислению и ферментации глюкозы, способ роста на средах Симмон- са и Клиглера. Это давало возможность выявить среди них S.

Генетическое типирование штаммов P. aeruginosa по методу RAPD- ПЦР проводилось совместно с кандидатом медицинских наук А.Е. Гончаро- вым. Для сравнения использовали культуры 219 и 1186, отнесенные к кло- нальным линиям А и С. Бактерии выращивали на плотной среде АГВ. Ге- номную ДНК выделяли обработкой суспензии бактерий (3-4 колонии поме- щали бактериологической петлей в 100 мкл стерильной воды в течение 15 минут при 95 ºС). После центрифугирования надосадочный раствор исполь- зовали в качестве образца ДНК. ПЦР-амплификацию проводили в 50 мкл ре- акционной смеси, куда вносили 5 мкл образца ДНК, 10 мкл праймера (из ра- бочего раствора 5 пмоль/мкл) и 34 мкл мастер-микс. Электрофорез амплико- нов проводили в 1,7 % геле агарозы в однократном ТБЕ буфере, в качестве молекулярного маркера брали 100bp DNA ladder (ООО «СибЭнзим»). Визуа- лизацию полос осуществляли после окрашивания геля бромистым этидием (5мкг/мл) с применением системы документации BioDocAnalyze (Biometra, Германия). Сравнительный анализ спектров амплифицированной ДНК оце- нивали визуально, без учета полиморфизма видимых RAPD-полос. Эпиде- миологический мониторинг циркулирующих в стационаре антибиотикорези- стентных штаммов условно-патогенных микроорганизмов осуществляли с помощью программы «Whonet» 5.4.