Исследования поствакцинального иммунного ответа у здоровых добровольцев

С целью определения иммунологической реакции на первичное и повторное введение вакцины ГамЭвак-Комби проводили оценку состояния клеточного и гуморального иммунного ответа у добровольцев на 28 и 42 дни от первого введения вакцины.

Напряженность клеточного иммунитета добровольцев, иммунизированных вакциной ГамЭвак-Комби, оценивали по количеству профилирующих CD4+ и CD8+ лимфоцитов периферической крови в условиях in vitroпосле рестимуляции гликопротеином вируса Эбола, а также по индукции экспрессии ИФН-гамма МКПК в условиях in vitroпосле рестимуляции гликопротеином вируса Эбола.

Напряженность гуморального иммунитета оценивали по титру GP- специфических IgG в сыворотке крови иммунизированных добровольцев после иммунизации, а также по вируснейтрализующей активности сыворотки крови добровольцев после иммунизации.

2.2.3.1. Определение напряженности гуморального иммунитета по количеству гликопротеин-специфических антител в сыворотке крови

Гуморальный иммунитет в ответ на введение вакцины «ГамЭвак-Комби» исследовали путем оценки титра IgG антител к антигену GP вируса Эбола в сыворотке крови вакцинированных добровольцев.

Для анализа титра образующихся IgG антител против антигена GP вируса Эбола в ответ на введение комбинированной векторной вакцины против лихорадки Эбола (Компонент А и Компонент Б) в ходе II этапа клинического

исследования, были двукратно вакцинированы 30 человек ½ дозы препарата (1 когорта) и 30 человек полной дозой препарата (2 когорта). Цельную кровь собирали из вены в вакуумные пробирки с активатором свертывания крови на 0 день (до иммунизации), 28, 42 и 360 день. Сыворотку из цельной крови выделяли в стерильных условиях, отбирали в отдельные пробирки и хранили при -70^оС.

Титр IgG антител к антигену GP вируса Эбола в образцах сыворотки крови оценивали методом иммуноферментного анализа (ИФА), используя в качестве антигена гликопротеин вируса Zaire Ebola 2014 (подтип Zaire, штамм H.sapiens-wt / GIN / 2014 / Kissidougou-C15) (Sino Biological, SB40442).

Затем вносили образцы сывороток крови добровольцев, последовательно разводили их с двукратным шагом от 1:12,5 до 1:102400 в растворе ФСБТ с 5% обезжиренным молоком и инкубировали в течение 1 часа при 37°С. Далее планшеты трижды промывали ФСБТ, в лунки планшета вносили по 100 мкл раствора вторичных антител, специфичных к Fc-фрагменту антител человека и конъюгированных с пероксидазой хрена, в ФСБТ с 5% обезжиренным молоком и инкубировали в течение 1 часа при 37^oC. Далее планшеты трижды промывали раствором ФСБТ и вносили по 100 мкл субстрата пероксидазы хрена - ТМБ. По окончании развития окраски реакцию останавливали путем внесения 100 мкл 4М H2SO4 и измеряли оптическую плотность при 450 нм.

За титр антител в сыворотке принимали максимальное разведение сыворотки, в котором значение оптической плотности (ОП) исследуемого образца сыворотки добровольца после иммунизации превосходит значение ОП контрольной сыворотки (сыворотка добровольца до иммунизации) более чем в 2 раза.

Таблица 4. Исследуемые показатели состояния добровольцев.

2.2.3.2. Определение напряженности гуморального иммунитета по вирус- нейтрализующей активности сыворотки периферической крови in vitro

Уровень вируснейтрализующих антител у иммунизированных добровольцев определяли в реакции нейтрализации (РН) по подавлению негативных колоний, образованных вирусом Эбола в монослое клеток GMK-AH-1(Д) под агаровым покрытием.

Сыворотки крови добровольцев инактивировали в аппарате АСИС при температуре 56^оС в течение 30 минут для удаления неспецифических ингибиторов. Разведение всех сывороток готовили на физиологическом растворе, начиная с 1:4, затем двукратным шагом до 1:64. Разведения вируссодержащей суспензии на основе вируса Эбола, штамм Заир, готовили на растворе Хенкса с 2% ФТС и антибиотиками (стрептомицина сульфата и бензилпенициллина калиевой соли по 100 ЕД/мл) десятикратным шагом. В приготовленном разведении концентрация вируса Эбола составила 200 БОЕ/мл.

Фоновые сыворотки крови добровольцев, ФТС, плацебо использовали в разведении 1:4.

Смесь равных объемов сыворотки и АГ вируса Эбола инкубировали в течение 60 минут при температуре от 36,5 до 37,5^оС, затем вносили по 0,5 мл на трехсуточный монослой клеток GMK-AH-1(Д), предварительно слив ростовую среду, и после адсорбции комплекса антиген-антитело на клетках в течение 60 минут при температуре 37,5^оС, наносили первичное агаровое покрытие, разработанное для вируса Эбола. Через 7 суток инфицированный монослой клеток окрашивали 0,1% нейтральным красным и инкубировали в течение не менее 24 часов при температуре 37,5^оС, и через 24 часа производили учет негативных колоний во флаконах.

За титр нейтрализующих антител исследуемой сыворотки принимали высшее ее разведение, которое подавляет на 50% и более (по сравнению с

контрольными сыворотками) негативные колонии, образованные вирусом Эбола, на культуре клеток под агаровым покрытием.

2.2.3.3. Определение напряженности клеточного иммунитета по количеству пролиферирующих лимфоцитов in vitro

Напряженность клеточного иммунитета здоровых добровольцев иммунизированных Комбинированной векторной вакциной против лихорадки Эбола оценивали по количеству пролиферирующих CD4+ и CD8+ лимфоцитов периферической крови в культуре in vitroпосле повторной стимуляции клеток рекомбинантным белком GP вируса Эбола.

Выделение мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) здоровых добровольцев проводили методом центрифугирования в градиенте плотности раствора фиколла. Затем клетки были рассеяны в 96-луночные планшеты в количестве 200 000 клеток/лунку. Далее клетки были рестимулированы рекомбинантным гликопротеином вируса Эбола (5мкг/лунку). В качестве положительного контроля использовали фитогемагглютинин (5мкг/лунку). В качестве отрицательного контроля использовали интакные клетки, к которым не добавляли белок вируса Эбола. Через 72 часа клетки собирали и анализировали методом проточной цитофлюориметрии с использованием проточного цитометра FACS Aria III. Пролиферирующие CD4+ или CD8+ T-лимфоциты были идентифицированы прямым и боковым рассеянием света, экспрессией CD3+, CD4+, CD8+ и низкой флуоресценцией красителя CFSE. Результирующий процент пролиферирующих клеток в каждом образце определяли путем вычитания результата полученного при анализе интактных клеток их результата, полученного в ответ на добавление в среду антигена GP вируса Эбола.

2.2.3.4. Определение напряженности клеточного иммунитета по продукции ИФН-гамма мононуклеарными клетками периферической крови в in vitro

Клеточный иммунитет при введении комбинированной вакцины оценивали по индукции экспрессии ИФН-гамма мононуклеарными клетками периферической крови (МКПК) иммунизированных лекарственным средством «Комбинированная векторная вакцина против лихорадки Эбола» здоровых добровольцев в ответ на стимуляцию гликопротеином GP вируса Эбола актуального штамма (субтип Заир, штамм H.sapiens-wt/GIN/2014/Kissidougou- C15).

Выделение мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) здоровых добровольцев проводили методом центрифугирования в градиенте плотности раствора фиколла. Затем клетки были рассеяны в 96-луночные планшеты в количестве 200 000 клеток/лунку. Далее клетки были рестимулированы рекомбинантным гликопротеином вируса Эбола (5мкг/лунку). В качестве положительного контроля использовали фитогемагглютинин (5мкг/лунку). В качестве отрицательного контроля использовали клетки, к которым не добавляли белок вируса Эбола. Через 72 часа собирали среду от стимулированных и нестимулированных клеток и анализировали концентрацию ИФН-гамма в среде с использованием коммерческого набора Human IFN gamma Platinum ELISA (Affymetrix eBioscience, BMS228CE) по протоколу фирмы- производителя.

После проведения ИФА строили калибровочную кривую на основе исследования стандартного образца, в которой значения оптической плотности коррелировали с концентрацией ИФН-гамма в образце. Далее на основе калибровочной кривой рассчитывали концентрацию ИФН-гамма в каждом образце и умножали на 2, поскольку перед анализом исследуемые образцы разводили в буфере для разведения образцов в 2 раза. Если концентрация ИФН - гамма в исследуемом образце до пересчета (до умножения) превышала 100 пг/мл, образец исследовали повторно, разводя его в 4-6 раз в зависимости от

предполагаемой концентрации, поскольку диапазон исследуемых концентраций с помощью используемого набора составляет от 1 до 100 пг/мл.

Индукцию экспрессии ИФН-гамма МКПК выражали в приросте концентрации ИФН-гамма (разы) при сравнении стимулированных клеток (рекомбинантным белком GP вируса Эбола или ФГА) и интактных. Прирост концентраций рассчитывали по формуле:

2.2.3.1. Определение титра вирус-нейтрализующих антител к рекомбинантному аденовирусу человека 5 серотипа

Уровень вируснейтрализующих антител у иммунизированных добровольцев определяли в реакции нейтрализации (РН) по подавлению негативных колоний, образованных рекомбинантным аденовирусом человека 5 серотипа в монослое клеток НЕК293 под агаровым покрытием. Реакцию нейтрализации ставили в варианте: постоянная доза вируса - разведения сыворотки.

2.2.4.