2.4. Молекулярно-генетические методы
Молекулярно-генетические методы исследования являются «золотым стандартом» диагностики и прогнозирования ГКМП. Нами были проведены исследования по оценке полиморфных вариантов генов-модификаторов — химазы (СМА1 A(-1903)G rs1800875), ангиотензиногена (AGТ M235T rs699), рецепторов ангиотензина II 1 типа (AGTR1 A1166C rs5186),
альдостеронсинтазы (CYP11B2 -344 T/C rs1799998), матриксной металлопротеиназы 3 (MMP3 -1171 5A/6A rs3025058) в группе наблюдаемых больных из 58 человек и аналогичной по структуре и количеству контрольной группе.
40 больным из группы ГКМП и 39 из контрольной группы проведено определение уровня нейрогуморальных маркеров сердечно-сосудистой системы ССС (MMP-3 - металлопротеиназы-3, TIMP-1, TIMP-2 — тканевых ингибиторов металлопротеиназы, AПФ — ангиотензин-превращающего фермента, коллагена IV, ангиотензина II.
Забор крови проводили из вены в объёме 3-5 мл по стандартной методике. Кровь помещали в пробирки с предварительно добавленным этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в качестве антикоагулянта (1 объем раствора 0,1 М Na2-ЭДТА, рН 8,0 (20оС) + 10 объемов крови). Кровь хранили при -20 °С .
Анализ генетического полиморфизма проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Разделение амплифицированных фрагментов ДНК проводили при помощи электрофореза в 7% полиакриламидном или 2% агарозном гелях с последующим окрашиванием гелей раствором бромистого этидия и визуализацией в проходящем ультрафиолетовом свете с использованием системы гель-видеодокументации
«Vilber Lormat» (Франция).
Выделение ДНК из венозной крови
Выделение дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) проводили методом фенольно-хлороформной экстракции. После этого последовательно проводили экстракцию ДНК равными объемами фенола, смеси фенола и хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием на каждой стадии в течение 10 мин.
В присутствии 100 мМ ацетата натрия (рН=4,8) осаждали ДНК из раствора двумя объемами охлажденного 70% этанола. Выход ДНК составлял 50-100 мкг на один мл образца крови. Преципитированную ДНК высушивали, а затем растворяли в 1,5 мл Н20. Раствор хранился при температуре -20°С.Полимеразная цепная реакция синтеза ДНК и рестрикционный анализ амплифицированных фрагментов ДНК
Амплификация проводилась с помощью ПЦР на термоциклере
«Терцик» производства компании «ДНК технология». Для этого использовалась реакционная смесь объемом 15 мкл, содержащая 1,5 мкл буфера (670 мМ трис-НСl, рН=8.6, 156 мМ (NH4)2SO4, 25 мМ MgCl2, 0,01%
Тритон Х-100), 10-30 нг геномной ДНК, смесь dNTP (dATP, dGTP, dCTP,
dTTP пo 200 мМ каждого), 1 единицу ДНК полимеразы Thermus aquaticus (производства фирмы «Силекс») и локус-специфичные олигонуклеотидные праймеры с определенной концентрацией в зависимости от амплифицируемого локуса (табл. 2.4).
Таблица 2.4 — Тип полиморфизма, последовательности праймеров и номенклатура аллелей полиморфных ДНК-локусов
Локус | Полиморфизм (rs номер) | Праймеры | Аллели |
AGTR1 (3q21-q25) | 1166A/C (rs5186) | F 5’ – CCT GCA CCA TGT TTT GAG GTT GAG TGA C – 3’ R 5’ – AAA ATA ACAGGACAAAAGCAGGCAGGGAG – 3’ | A (352 п.о.) C (238 и 114 п.о.) |
CMA1 (14q11.2) | -1903G/A (rs1800875) | F 5’ – GGA AAT GTG AGC AGA TAG TGC AGT C – 3’ R 5’ – AAT CCG GAG CTG GAG AAC TCT TGT C – 3’ | A (285 п.о.) G (195 и 95 п.о.) |
CYP11B2 (8q22) | -344 T/C (rs1799998) | F 5’ – CAG GAG GAG ACC CCA TGT GAC – 3’ R 5’ – CCT CCA CCC TGT TCA GCC C – 3’ | T (273 п.о.) C (202 и 71 п.о.) |
AGT | M235T (rs699) | F 5' – GATGCGCACAAGGTCCTGTC - 3' R 5' – CAGGGTGCTGTCCACACTGGCTCGC – 3’ | T235 (303 п.о.) M235 (266 и 37 п.о.) |
MMP-3 | -1171 5A/6A (rs3025058) | F 5' – GATTACAGACATGGGTCACG - 3' R 5' – TAAAATATAGCAAACTTTTG - 3' |
Методы электрофоретического разделения амплифицированных фрагментов ДНК
При помощи электрофореза в 7% полиакриламидном или 2% агарозном гелях проводили разделение амплифицированных фрагментов ДНК. Электрофорез выполнялся в однократном ТВЕ буфере (0,089 М трис, 0,089 М борная кислота, 0,002 М ЭДТА, рН=8.0).
Перед нанесением на гель пробы смешивали с краской, содержащей 0,25% бромфеноловый синий, 0,25% ксиленцианол и 15% фикол. Затем гель окрашивали раствором бромистого этидия и анализировали в проходящем ультрафиолетовом свете. Для этой цели использовали систему гель-видеодокументации «Vilber Lormat».Определение маркеров, характеризующих систему РААС и систему матриксных металллопротеиназ
- определение MMP-3- матриксная металлопротеиназа 3. На основе количественного твердофазного иммуноферментного анализа с использованием набора BMS2014 Bender Medsystems Матриксная металлопротеиназа-3 (MMP-3), 96.
- определение TIMP-1- тканевой ингибитор металлопротеиназы 1 на основе количественного твердофазного иммуноферментного анализа с использованием набора BMS2018 Bender Medsystems Тканевой ингибитор металлопротеиназы-1 (TIMP-1), 96
- определение TIMP-2 — тканевой ингибитор металлопротеиназы 2 на основе количественного твердофазного иммуноферментного анализа с использованием набора DTM200 BCM Diagnostics Тканевой ингибитор металлопротеиназы-2 (TIMP-2), 96
- определение АПФ на основе количественного твердофазного иммуноферментного анализа
- определение ангиотензина II на основе количественного твердофазного иммуноферментного анализа с использованием набора EA3501-1 BCM Diagnostics Ангиотензин II, 96
- определение коллаген IV на основе количественного твердофазного иммуноферментного анализа с использованием набора BIO82 BCM Diagnostics Коллаген IV типа в сыворотке, 96.
Еще по теме 2.4. Молекулярно-генетические методы:
- Методы молекулярно-генетического анализа
- Основные методы молекулярно-генетического типирования, применяемые в системе эпидемиологического надзора за ИСМП.
- Принципы выбора метода молекулярно-генетического типирования для решения практических задач эпидемиологического надзора за ИСМП.
- Генетические маркеры, используемые при молекулярно-генетическом типировании ведущих возбудителей ИСМП
- Молекулярно-генетическая идентификация микобактерий
- Показания к проведению молекулярно-генетического типирования возбудителей ИСМП
- ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА ЗА ВОЗБУДИТЕЛЯМИ ИСМП.
- Генетические и молекулярные аспекты эндометриоза яичников как опухолевого процесса
- Состояние кишечной микрофлоры по данным молекулярно- генетического исследования (секвенирование 16S рРНК)
- МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ МОНИТОРИНГ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ИСМП, ПРОВОДИМЫЙ В ЛАБОРАТОРИЯХ, ВЫПОЛНЯЮЩИХ ФУНКЦИИ РЕФЕРЕНСНЫХ.
- НОВЫЕ ПОДХОДЫ К МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ДЕТЕКЦИИ МИКРОБИОТЫ ПРИ ОБОСТРЕНИИ ХРОНИЧЕСКОЙ ОБСТРУКТИВНОЙ БОЛЕЗНИ ЛЕГКИХ
- Молекулярно-генетический мониторинг в системе эпидемиологического надзора за инфекциями, связанными с оказанием медицинской помощи. Федеральные клинические рекомендации - М.,2014. - 45 с., 2014
- Использование методов филогенетического анализа при молекулярногенетическом типировании возбудителей ИСМП.
- Молекулярная диагностика
- Молекулярно-эпидемиологический мониторинг за ВИЧ-инфекцией
- Молекулярно-эпидемиологический мониторинг механизмов резистентности возбудителей ИСМП к антимикробным препаратам.
- Глава 34 ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕНЕТИЧЕСКИ ОБУСЛОВЛЕННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
- Глава 7. МОЛЕКУЛЯРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВИЧ- ИНФЕКЦИИ В ДАЛЬНЕВОСТОЧНОМ ФЕДЕРАЛЬНОМ ОКРУГЕ.