Структура бактериальной клетки и химический состав микроорганиз­мов

Бактерии I и II отделов - это простейшие одноклеточные организмы, не имеют хлорофилла. Содержат нуклеиновую кислоту, белки, полисахариды, липиды, мине­ральные вещества, воду, микроэлементы.

Все эти структуры выявлены различными методами. Их величину определяют ультрацентрифугированием, ультрафильтрацией, микроскопией с использованием микрометра. Она колеблется от 0,1 нм до 10-20 нм (1000 нм=1 мкм; 1000 мкм=1 мм).

Оболочка бактерий состоит из трех слоев: слизистого (поверхностного), соб­ственно клеточной стенки и ЦПМ - цитоплазматической мембраны.

Слизистый слой располагается поверх клеточной стенки, состоит из высокопо- лимерных мукополисахаридов, которые не имеют с клеточной стенкой постоянной и прочной связи.

Клеточная стенка бактерий и грибов располагается между цитоплазматической мембраной и капсулой (если она имеется) или ионизированным слоем внешней среды (рис. 1 и 2).

Толщина клеточной стенки колеблется от 10 до 35 нм. Клеточная стенка состав­ляет 10-50% сухой массы бактерий, построена из полимеров или блоков, включающих липопротеиды, липополисахариды, протеины, тейхоевые кислоты.

Главным и специфичным для клеточной стенки компонентом является муреин или пептидогликан. Он имеется только у эубактерий (кроме микоплазм). Пептидогли­кан включает в себя остов и два набора пептидных цепочек - боковых и поперечных. Остов состоит из остатков N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты, свя­занных между собой β-гликозидными связями. Основу пептидов связи составляют тетрапептиды, состоящие из чередующихся L- и D-аминокислот, например, L-аланин- D-глютаминовая кислота- мезодиаминопимелиновая кислота-Э-аланин.

В тетрапептидной боковой цепочке у большинства грамотрицательных бактерий имеется диаминопимелиновая кислота - уникальный компонент клеточной стенки, который имеется только у прокариотов.

У грамотрицательных бактерий клеточная стенка слоиста. Внутренний слой по­строен из пептидогликана (5-10%), не содержит тейхоевых кислот. Наружная мембра­на имеет вид волнообразной трехслойной структуры, сходной с цитоплазматической мембраной. Основной компонент этих мембран - двойной слой липидов. Наружная мембрана представлена липополисахаридами, фосфолипидами и белками. В состав белков, заключенных в фосфолипидную матрицу, входят 3 или 4 основных («мажор­ных»), которые составляют 70% суммарных белков наружной мембраны; два из ос­

новных белков проходят через оба слоя мембраны и прочно связаны с пептидоглика­ном. Эти белки-порины располагаются в виде триплетов и образуют диффузионные поры, через которые в клетку проникают мелкие гидрофильные молекулы. Второсте­пенные белки участвуют в облегченной диффузии и активном транспорте молекул, участвуют в конъюгации (являются рецепторами для донорских ворсинок), в контроле репликации ДНК и регуляции клеточного деления.

С внешней её стороны располагается липополисахарид (ЛПС), состоящий из трех компонентов: липида А, базисной части (ядра) и О-специфической цепи полисахари­да, образованной повторяющимися идентичными олигосахаридными последователь­ностями.

ЛПС грамотрицательных бактерий обладает токсическими свойствами (связан с эндотоксином) и выраженными антигенными свойствами (О-антиген определяет се- рогруппу, серовар), по которым можно дифференцировать бактерии. Кроме того, ЛПС в организме запускает синтез около 20 различных биологически активных соедине­ний, которые опосредуют патогенез эндотоксикоза и обладают пирогенным действи­ем.

Клеточная стенка грамположительных бактерий имеет однородную структуру, пластичный слой тонкий и ковалентно связан с ригидным слоем. Она толще, чем у грамотрицательных бактерий - 20-60 нм. У грамположительных бактерий клеточная стенка на 60-90% состоит из пептидогликана и тесно связанных с ним тейхоевых кис­лот. Тейхоевые кислоты (от греч. teichos- стенка) - растворимые в воде линейные по­лимеры, содержащие остатки глицерина или рибитола, связанные между собой фос- фодиэфирными связями.

Способность грамположительных бактерий при окраске по Граму удерживать генцианфиолетовый в комплексе с иодом (сине-фиолетовая окраска бактерий) связана со свойством многослойного пептидогликана взаимодействовать с краской. Обработ­ка окрашенного по Граму мазка бактерий спиртом вызывает сужение пор в пептидо­гликане и задержку красителя в клеточной стенке. Наоборот, грамотрицательные бак­терии после воздействия спиртом утрачивают краситель, обесцвечиваются, поры от­крываются и при обработке фуксином бактерии окрашиваются в красный цвет.

Пептидогликан может разрушаться под действием фермента лизоцима (мурами­дазы), гидролизующего связи между ацетилглюкозамином и ацетилмурамовой кисло­той.

Клеточная стенка выполняет следующие функции:

* определяет и сохраняет постоянную форму микробной клетки;

* является осмотическим барьером, защищает внутреннюю часть клетки от действия механических и осмотических сил внешней среды;

* имеет своеобразное строение в виде «сита», через ее поры в клетку проникают питательные вещества, а из клетки выделяются продукты метаболизма, токсины, ферменты;

* участвует в регуляции роста и деления клеток;

* в клеточной стенке находятся гидролитические ферменты. Они обеспечивают рост клеточной стенки, а при гибели - аутолиз её;

* защищает клетку от неблагоприятных воздействий (температура, химические вещества);

* в ней локализуются основные антигенные детерминанты для взаи­модействия со специфическими антителами и бактериофагами;

* имеет сложный химический состав, который позволяет дифферен­цировать клетки на грамположительные и грамотрицательные;

Способы выявления клеточной стенки:

* опыт Фишера - клетку помещают в гипертонический раствор соли или сахара. Вещества из клетки выходят в сторону большего осмотического дав­ления - клеточная стенка отслаивается от цитоплазмы и видна в световом мик-

константе седиментации;

* действие лизоцима или антибиотиков приводит к растворению кле­точной стенки.

Если клеточная стенка полностью разрушается - образуются протопласты или L-формы бактерий. В отличие от протопластов, L-формы способны размножаться. Они бывают стабильные, если не восстанавливаются в исходную форму, и нестабиль­ные (восстанавливаются). Если клеточная стенка растворяется частично, то образуется сферопласт.

Цитоплазматическая мембрана. Цитоплазматическая мембрана имеет три слоя - двойной фосфолипидный и глобулярный белковый. Она ограничивает цитоплазму, поддерживает постоянство осмотического давления, необходимого для нормального метаболизма клетки, контролирует водный и солевой обмен, обеспечивает питание бактерий за счет ферментов-пермеаз, расположенных в ЦПМ. За счет окислительно­восстановительных ферментов ЦПМ принимает участие в процессах дыхания. ЦПМ участвует в делении клетки, биосинтезе компонентов клеточной стенки и капсулы, в регуляции процессов репликации и сегрегации хромосом и плазмид.

Имеется система внутренних мембран - мезосомы - это аналоги митохондрий. Они являются производными ЦПМ, связаны с нуклеоидом. Принимают участие в де­лении клеток, в распределении дочерних нуклеоидов в делящихся клетках, участвуют в спорообразовании, в синтезе материала клеточной стенки, в энергетическом метабо­лизме.

Цитоплазма - это коллоидная масса, заключенная в оболочку. Химический со­став её сложный (белки, полисахариды, липиды, РНК, микроэлементы, минеральные вещества).

В электронном микроскопе в цитоплазме выявлены: эндоплазматическая сеть, рибосомы и гранулярные образования.

Рибосомы - структуры, в которых идет синтез белка. В свободном состоянии ри­босомы могут находиться в виде 2 субъединиц с константой седиментации 30S и 50S. Перед синтезом белка субъединицы объединяются в рибосому с константой седимен­тации 70S. Количество рибосом в клетке колеблется от 5 до 10000. Часто они группи­руются в полисомы - полирибосомы.

Гранулы гликогена, крахмала, жира, зерна волютина (полифосфаты) играют тро­фическую и диагностическую роль (у дифтерийной палочки зерна волютина распола­гаются по полюсам и интенсивно прокрашиваются «метахромазия»). В цитоплазме могут быть плазмиды - участки дополнительного генетического материала, представ­ленные двойной нитью ДНК, обеспечивающие определенные свойства бактерий (см. в разделе генетики бактерий).

Нуклеоид (хромосома). Нуклеоид бактерий содержит циркулярно-замкнутую двойную нить ДНК, располагается в цитоплазме в виде клубка. У нуклеоида нет ядер- ной оболочки, ядрышек, белков гистонов и протаминов; при этом микробная клетка не делится митозом, т.к. нет митотического аппарата.

В нуклеоиде есть ДНК, РНК и ферменты, в частности РНК-полимераза. РНК и РНК-полимераза находятся в центре, а на них намотана ДНК, которая расположена компактно. Один конец ДНК связан с мезосомами ЦПМ, что способствует разделе­нию дочерних хромосом при репликации. Бактерии - гаплоидные существа. Содержат 1 молекулу ДНК, ее можно рассматривать как одиночную хромосому, в расправлен­ном состоянии ее длина 1 мм.

Форма нуклеоида различна: сферическая, палочковидная, подковообразная. В клетке в зависимости от физиологического состояния может быть один или кратное двум количество нуклеоидов. В молодых клетках - несколько, в старых - 1, у кокков - 1, у палочковидных - много.

Функции нуклеоида: хранитель генетической информации, которая закодирована в ДНК; принимает участие в генетических процессах (мутациях, рекомбинациях), а также в делении бактерий и спорообразовании.

Доказательства наличия нуклеоида:

- цитохимическая реакция Фельгена на ДНК. На мазок бактерий наносят соляную кислоту, при этом из дезоксирибозы образуются альдегиды, которые с фуксинсерни- стой кислотой реактива Шиффа дают фиолетовое окрашивание;

- люминесцентная микроскопия: при окраске мазка акридиновым оранжевым ДНК в ультрафиолете светится зеленым светом, РНК - красным;

- электронная микроскопия ультратонких срезов.

Жгутики - органы передвижения бактерий. Это тончайшие длинные нити (3 - 5х12-25 нм), одетые чехлом белковой природы, берут начало в цитоплазме и связаны с телом клетки при помощи дисков. Наружный диск находится в клеточной стенке, внутренний в ЦПМ. В состав жгутиков входит белок флагеллин, он относится к числу сократительных белков, обладает высокой антигенной активностью и специфично­стью (см. Н-антиген).

Для изучения жгутиков существуют прямые и косвенные методы. Прямые - это электронная микроскопия и световая после окраски по Лёффлеру. Косвенные - посев уколом в столбик полужидкого агара и микроскопия нативного материала в препара­тах «висячая» и «раздавленная» капли в световом и фазово-контрастном микроскопах.

По наличию жгутиков и их расположению микробы разделяются на монотрихи - имеют 1 жгутик, лофотрихи - пучок жгутиков с одной стороны, амфитрихи - по од­ному жгутику или по пучку жгутиков по полюсам, перитрихи - жгутики по всей по­верхности тела клетки, атрихи - без жгутиков.

Помимо жгутиков есть ворсинки (пили, бахромки) - это органы прикрепления. Наиболее изучены 2 вида пилей - половые (sex) пили, через которые идет передача генетического материала из клетки донора в клетку реципиента в процессе конъюга­ции, и пили, обеспечивающие прикрепление или адгезию бактерий к определенным клеткам организма хозяина.

Фибриллы (периплазматические жгутики) - органы передвижения у спирохет, они состоят из отдельных переплетающихся нитей и располагаются между клеточной стенкой и ЦПМ.

Споры - покоящиеся формы жизненного цикла бактерий, образуются внутри ци­топлазмы вегетативных клеток в неблагоприятных условиях существования и обеспе­чивают сохранение вида. В спорах микробы находятся в состоянии анабиоза. Микро­бы, образующие споры, называются бациллами (аэробы) или клостридиями (анаэроб­ные бактерии, имеющие форму веретена). Споры отличаются от вегетативной клетки тем, что происходит репрессия генома и клетка переходит в состояние анабиоза, при котором отсутствует обмен веществ, вода переходит из свободного состояния в свя­занное, повышается концентрация ионов кальция, появляется дипиколиновая кислота, которая обусловливает термоустойчивость споры.

Процесс спорообразования сходен у большинства бактерий. Вначале образуется дополнительный нуклеоид, который отходит к одному из полюсов клетки. Затем в ЦПМ образуется инвагинация, разделяющая клетку на 2 протопласта, каждый из ко­торых содержит 1 хромосому. Меньший из протопластов - проспора (предспора) - покрывается второй оболочкой, которая синтезируется мембраной материнской клет­ки. В оболочке клетки содержится дипиколиновая кислота и ионы кальция. Далее между двумя листками мембраны формируется специфический для споры кортикаль­ный слой (кортекс), состоящий из пептидогликана, который отличается по составу от пептидогликана клеточной стенки. Снаружи спора покрывается толстой рыхлой обо­лочкой - экзоспориумом, содержащей немного углеводов. Белковая оболочка споры богата остатками цистеина и лизина и обладает гидрофобностью. После этого насту­пает аутолиз вегетативной клетки.

При попадании споры в благоприятные условия происходит активация споры и ее прорастание в вегетативные клетки. Идет дерепрессия генома, мобилизация мета­болических процессов, из клетки удаляется дипиколиновая кислота, ионы кальция, разрушается пептидогликан кортекса.

Прорастание спор включает три стадии: активацию, начальную стадию и ста­дию роста.

Активация является обязательным условием прорастания спор. Она осуществля­ется различными воздействиями: снижением рН, веществами, содержащими свобод­ные сульфгидрильные группы, повышением температуры, механическим поврежде­нием спор.

Начальная стадия: происходит активация автолизина, который разрушает пепти­догликан кортекса, в спору поступает вода, выходит дипиколинат кальция.

Стадия роста. После разрушения кортекса и наружных слоев споры появляется вегетативная клетка, которая при наличии питательных веществ удваивает свою био­массу, делится на две дочерние клетки, которые далее активно размножаются. Про­

цесс прорастания споры контролируется генами как спорового, так и вегетативного геномов.

Для обнаружения спор используют электронную микроскопию, а также специ­альный метод окраски по Ожешко, на первом этапе которого нефиксированный мазок обрабатывают в течение 1-2 минут 0,5% р-ром HCl при подогревании, а далее препа­рат окрашивают по методу Циль-Нильсена. Споры окрашиваются в красный цвет, а вегетативные клетки - в синий. При простых методах окраски оболочка не пропускает красители, споры сильно преломляют свет и видны в микроскопе как прозрачные зер­на.

Капсула - структура бактериальной клетки, которая расположена на поверхно­сти клеточной стенки и тесно связана с ней. Она состоит из высокогидрофильных ми­целл гетерополисахаридов (у кишечных бактерий), белков (у стрептококков), поли­пептидов (бацилл сибирской язвы). В зависимости от толщины слоя и прочности со­единения с телом различают капсулу или макрокапсулу, которая видна в световом микроскопе, микрокапсулу (К-антиген), которая выявляется при электронной микро­скопии, серологическими и химическими методами, и слизистый слой, который не­прочно связан с клеточной стенкой и состоит из экстрацеллюлярных веществ микро­ба.

У некоторых бактерий капсула постоянна, содержится у всех особей и во всех средах (Klebsiella pneumoniae, S. pyogenes).У пневмококков, возбудителей сибирской язвы, C. perfringensкапсульное вещество образуется только в макроорганизме, а на питательных средах синтез его прекращается. Капсула является важным фактором ви­рулентности, защищает бактерии от действия фагоцитов, связывает ионы тяжелых ме­таллов, защищает от действия антител, комплемента и от высыхания. Определение капсулы используют для классификации и идентификации бактерий и установления их вирулентности. Капсула выявляется при специальных методах окраски (метод Бурри-Гинса), создающих негативное контрастирование вещества капсулы тушью.

2.3.