Лекция 4 Бактериофаги. Генетика микроорганизмов.
Бактериофаги (от лат. bacteriophaga - пожирающий бактерии) - вирусы микроорганизмов.
Бактериофагия - процесс взаимодействия фагов с бактериями, нередко заканчивающийся их лизисом.
Различают 5 основных морфологических групп бактериофагов:
• фаги с длинным сокращающимся отростком;
• фаги с длинным несокращающимся отростком;
• фаги с коротким отростком;
• фаги с аналогом отростка (пузырчатые);
• нитевидные фаги.
Бактериофаги подразделяют на вирулентные — способные вызвать продуктивную форму инфекции, и умеренные — способные вызывать не только продуктивную, но и редуктивную фаговую инфекцию.
Жизненный цикл фага может проявляться в следующих формах:
• продуктивная инфекция (фаг размножается в клетке и выходит из нее);
• редуктивная инфекция (геном фага проникает в клетку, однако размножения фага не происходит, его геном интегрируется в хромосому клетки-хозяина, становится ее составной частью, фаг превращается в профаг, а клетка становится лизогенной);
• абортивная инфекция, при которой взаимодействие фага с клеткой обрывается на какой-то стадии жизненного цикла фага, и он погибает.
Цикл развития вирулентного бактериофага — этапы:
• адсорбция фага на поверхности бактериальной клетки;
• проникновение фаговой ДНК в бактериальную клетку;
• эклипс-период или СИ-фаза, т.е. фаза смены информации;
• синтез структурных компонентов фага;
• морфогенез фагов;
• лизис клетки и освобождение фаговых частиц.
Цикл развития умеренного бактериофага - этапы:
• адсорбция фага на поверхности клетки;
• проникновение фаговой ДНК в бактериальную клетку;
• интеграция фаговой ДНК в хромосому клетки-хозяина и превращение фага в профаг, формирование лизогенной системы.
Профаг спонтанно или под воздействием различных факторов (химические вещества, облучение УФ, рентгеновскими лучами, повышенная температура) может выходить из бактериальной хромосомы и вызывать продуктивную инфекцию.
Умеренные и дефектные фаги
Встраиваясь в бактериальную хромосому, умеренные или дефектные фаги вызывают лизогенизацию бактерий, которые могут приобретать новые признаки. Изменчивость лизогенных бактерий может быть связана:
• с приобретением генов, переносимых фагами от их предыдущих хозяев;
• с экспрессией «молчащих» генов бактерий-реципиентов. Фаговая ДНК, встраиваясь вблизи поврежденного промотора, заменяет его. При этом синтезируются определенные продукты, например протоксины дифтерийных бактерий.
Благодаря своему разрушающему (литическому) действию на бактерии фаги могут быть использованы с лечебно-профилактической целью при различных заболеваниях (дизентерия, холера, различные гнойновоспалительные заболевания и т. д.). Наборы стандартных фагов, в том числе международные используются для фаготипирования возбудителей ряда болезней (холеры, брюшного тифа, сальмонеллезов, дифтерии, стафилококковых и других заболеваний).
Практическое использование бактериофагов:
• фаготерапия;
• фагопрофилактика;
• фагодиагностика.
ГЕНЕТИКА — наука, изучающая механизмы и закономерности наследственности и изменчивости организмов, а также методы управления этими процессами.
Ген — наследственный фактор, единица наследственного материала — определенный участок молекулы ДНК у высших организмов (РНК у ряда вирусов), ответственный за синтез определенного белка.
Генотип — совокупность всех генов организма, его наследственная материальная основа.
Фенотип — совокупность всех признаков и свойств организма, сформировавшихся на основе взаимодействия генотипа с условиями внешней среды.
Генетический материал у бактерий содержится в нуклеоиде (бактериальной хромосоме) и во внехромосомных генетических элементах — плазмидах и мигрирующих генетических элементах.
Внехромосомные факторы наследственности
1) автономные - являются репликоном:
• плазмиды
2) неавтономные — реплицируются только в составе репликона (нуклеоида или плазмиды):
• IS-последовательности;
• транспозоны;
• умеренные и дефектные фаги.
Внехромосомные молекулы ДНК (инсерционные элементы, плазмиды, транспозоны) не являются жизненно важными для бактерий, но придают им новые свойства.
Инсерционные элементы (IS)(от англ. insertion sequence) — простейший тип генетических элементов, мигрирующих от одной бактериальной хромосомы к другой, или между хромосомой и плазмидой. IS-элементы несут только один ген, кодирующий белок транспозазу, с помощью которой IS-элементы встраиваются в различные участки хромосомы. Содержат только гены, необходимые для собственной миграции. Фенотипических признаков не кодируют, самостоятельно не реплицируются.
Свойства IS-последовательностей:
• небольшие размеры — 800-1400 пар нуклеотидов;
• в свободном состоянии не существуют;
• способны перемещаться по геному, при этом первичный элемент остается на месте, а копия встраивается в мишень.
Функции IS-элементов:
• координация взаимодействия внехромосомных факторов наследственности между собой и с бактериальной хромосомой для обеспечения их рекомбинации;
• регуляторная (регуляция транскрипции генов путем их «включения/выключения»);
• индукция мутаций (инверсии, дупликации на протяжении 5-9 пар нуклеотидов) координация взаимодействия плазмид, умеренных фагов, транспозонов.
Транспозоны — нуклеотидные последовательности, способные менять место своей локализации в молекуле ДНК и мигрировать из одной молекулы ДНК в другую.
Свойства транспозонов:
• относительно большие генетические элементы, состоят из 2000-25000 пар нуклеотидов;
• могут находиться в свободном состоянии в виде кольцевой молекулы;
• могут мигрировать с одного репликона на другой;
• окружены с обоих сторон (фланкированы) последовательностями ДНК, напоминающими IS-последовательности;
• могут нести информацию о синтезе бактериальных токсинов и ферментов, модифицирующих антибиотики.
Плазмиды — кольцевидные молекулы ДНК, способные к саморепликации. Их возможные состояния:
• автономное (в цитоплазме);
• интегрированное (в нуклеоиде).
Конъюгативные плазмиды способны к самопереносу из одной клетки в другую. Неконъюгативные плазмиды способны к переносу с помощью конътативных плазмид и бактериофагов.
Функции плазмид:
• регуляторная - компенсирует нарушение функции ДНК нуклеоида;
• кодирующая - вносит в генотип новую информацию.
Плазмиды подразделяются на различные категории в зависимости от свойств, которые они кодируют у бактерий.
F-плазмида, или половой фактор. Контролирует синтез половых ворсинок (sex или F-pili), которые способствуют эффективному спариванию бактерий-доноров с реципиентными клетками при конъюгации. F- плазмида реплицируется в независимом от хромосомы состоянии и передается при конъюгации в клетки бактерий-реципиентов.
Перенос генетического материала (ДНК) детерминируется tra-опероном F- плазмиды (от англ. transfer — перенос), обеспечивающим конъюгативность. F-плазмиды содержат только tra-оперон, в их составе нет никаких других генов.
F-плазмида может встраиваться в бактериальную хромосому и находиться с ней в интегрированном состоянии.
Функции tra-оперона:
• детерминирует образование конъюгативных пилей;
• моблизирует на перенос:
- саму конъюгативную плазмиду (F+);
- другую, неконъюгативную, плазмиду;
- участок нуклеоида.
R-плазмиды (плазмиды множественной лекарственной устойчивости). Известно большое количество R-плазмид, определяющих устойчивость бактерий к лекарственным препаратам. Передача R-плазмид привела к их широкому распространению среди бактерий и значительно осложнило химиотерапию инфекционных заболеваний.
Состав R-плазмид:
• г-оперон(-ы) + tra-оперон;
• г-оперон(-ы).
Пути передачи R-плазмид:
• при трансдукции (грамположительные бактерии);
• при конъюгации (грамотрицательные бактерии).
Состав r-оперона:
• гены, детерминирующие синтез ферментов:
— инактивирующие антибиотик;
— модифицирующий антибиотик;
— снижающие проницаемость клеточной стенки бактериальной клетки к антибиотику;
• может содержать:
— транспозон;
— IS-последовательность.
Бактериоциногенные плазмиды (на примере Col-плазмиды E.coli) — плазмиды, детерминирующие синтез колицинов (антибиотикоподобных веществ).
Состав Col-плазмид:
• гены, детерминирующие синтез колицина;
• tra-оперон.
Особенности Col-плазмид:
• редко интегрируют в нуклеоид;
• обычно репрессированы;
• при их дерепрессии бактериальная клетка синтезирует колицины и погибает (потенциально летальная плазмида).
Свойства бактериоцинов:
• представляют собой вещества белковой природы и функционируют как антибиотики с узким спектром действия;
• вызывают гибель клетки, не нарушая ее целостности;
• ингибируют синтез ДНК, РНК и белка;
• обладают свойствами эндодезоксирибонуклеаз;
• обладают летальным признаком - после выделения бактериоцина бактериальная клетка может погибнуть;
• клетка, выделяющая бактериоцины, устойчива к действию гомологичных бактериоцинов извне.
ИЗМЕНЧИВОСТЬ БАКТЕРИЙ
Может быть ненаследуемой (модификационной) и генотипической (мутации, рекомбинации).
Модификации — временные, наследственно не закрепленные изменения, возникающие как адаптивные реакции бактерий на изменения окружающей среды. Модификации находятся под контролем генома, но не сопровождаются изменениями первичной структуры ДНК и вскоре утрачиваются. Модификации проявляются в изменении морфологических, биохимических и ряда других признаков.
Биохимическую основу модификации составляет индуцибельный синтез ферментов. Так, например, кишечная палочка только в присутствии лактозы синтезирует ферменты, необходимые для ее расщепления.
Лактозный оперон состоит из трех линейно расположенных структурных генов, деятельность которых контролируется геном-регулятором.
Структурные гены детерминируют образование трех катаболических ферментов: бета-галактозидазы, трансацетилазы и пермеазы. Работа структурных генов зависит от гена-регулятора и наличия в среде лактозы. Ген-регулятор контролирует образование белка-репрессора. Белок-репрессор при отсутствии лактозы связывается с оператором и блокирует транскрипцию. Поступая в клетку, лактоза связывается с белком-репрессором, в результате освобождается оператор и включается синтез катаболических ферментов на структурных генах.
После полной утилизации лактозы белок-репрессор освобождается и вновь связывается с оператором, блокирует процесс синтеза ферментов.
R-S-диссоциация бактерий — это образования двух форм бактериальных клеток, которые отличаются друг от друга по характеру образуемых ими колоний на тплотной питательной среде. Один тип — R-колонии (англ. rough — неровный) — характеризуется неровными краями и шероховатой поверхностью, второй тип — S-колонии (англ. smooth — гладкий) — имеет круглую форму, гладкую поверхность.
Диссоциацию большинство ученых рассматривают как закономерную форму модификации, а некоторые относят ее к мутациям.
Процесс диссоциации обычно протекает в одном направлении: от S- к R- форме. Обратный переход R- в S-форму наблюдается реже. Для
большинства вирулентных бактерий характерен рост в виде S-формы колоний.
В процессе диссоциации одновременно с изменением морфологии колоний меняются биохимические, антигенные, патогенные свойства бактерий, их устойчивость к физическим и химическим факторам внешней среды.
S-R-диссоциация во многих случаях усложняет бактериологическую диагностику инфекционных заболеваний.
Свойства бактерий из S- и R-колоний
S-колонии | R-колонии |
Гладкие с ровными краями | Шероховатые с изрезанными краями |
Диффузно-мутящий рост в МИБ | Придонный рост в МИБ |
Обычно вирулентны | Обычно не вирулентны, за исключением возбудителей туберкулеза, сибирской язвы, дифтерии, чумы |
У капсульных видов есть капсула | Капсула отсутствует |
У подвижных видов есть жгутики | Жгутики отсутствуют |
Чувствительны к фагу | Мало чувствительны к фагу |
Биохимически более активны | Биохимически менее активны |
Полноценны в антигенном отношении | Неполноценны в антигенном отношении |
ГЕНОТИПИЧЕСКАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ БАКТЕРИЙ
Мутации — это изменения в первичной структуре ДНК, которые выражаются в наследственно закрепленной утрате или изменении какого- либо признака. Одновременно у бактерий имеются различные механизмы репарации мутаций, в том числе с использованием ферментов — эндонуклеаз, лигаз, ДНК-полимеразы.
Генетические рекомбинации
Трансформация — форма генетической изменчивости, при которой бактерия-реципиент поглощает из внешней среды трофическим путем фрагменты ДНК бактерии-донора. Это приводит к образованию рекомбинантных бактерий, обладающих некоторыми свойствами донорских клеток.
Процесс трансформации бактерий можно подразделить на несколько фаз:
1)адсорбция ДНК-донора на клетке-реципиенте;
2) проникновение ДНК внутрь клетки-реципиента;
3) соединение ДНК с гомологичным участком хромосомы реципиента с последующей рекомбинацией.
Эффективность трансформации зависит от степени гомологичности ДНК донора и реципиента. Чем выше гомологичность, тем эффективнее спаривание, и тем больше образуется рекомбинантных бактерий. Межвидовая трансформация происходит гораздо реже, чем внутривидовая.
Трансдукция — перенос генетического материала от клетки-донора к клетке-реципиенту с помощью умеренного бактериофага. Фаг переносит небольшой фрагмент ДНК бактерии-донора. В результате трансдукции бактерия-реципиент приобретает новые фенотипические признаки: ферментативные свойства, устойчивость к антибиотикам, вредным воздействиям окружающей среды, вирулентность и др. При выходе бактериофага из клетки фрагмент донорской трансдуцированной ДНК остается в хромосоме клетки-реципиента, а следовательно, сохраняются и новые фенотипические признаки. Бактериофаг при трансдукции выполняет только транспортную функцию.
Типы трансдукций
1. Неспецифическая трансдукция. В процессе репродукции фага в момент сборки фаговых частиц в их головку вместе с фаговой ДНК может проникнуть какой-либо фрагмент ДНК бактерии-донора. В клетки реципиентного штамма могут быть перенесены любые гены донора. Принесенный фагом фрагмент ДНК бактерии-донора способен включаться в гомологическую область ДНК клетки-реципиента путем рекомбинации. Фаги являются только переносчиком генетического материала от одних бактерий к другим. Фаговая ДНК не участвует в образовании рекомбинантов.
2. Специфическая трансдукция осуществляется фагами, обладающими избирательной локализацией на хромосоме бактерий. Образование трансдуцирующего фага происходит путем выщепления профага из бактериальной хромосомы вместе с генами, расположенными на хромосоме клетки-донора рядом с профагом. При взаимодействии трансдуцирующих фагов с клетками реципиентного штамма происходит включение гена бактерии-донора вместе с ДНК дефектного фага в хромосому бактерии-реципиента.
3. Абортивная трансдукция. Принесенный трансдуцируемый фагом фрагмент ДНК донора не включается в хромосому клетки-реципиента, а остается в ее цитоплазме и в таком виде способен поддерживаться и проявляться фенотипически.
Во время деления бактериальной клетки трансдуцированный фрагмент ДНК может передаваться только одной из двух дочерних клеток, т.е. наследоваться однолинейно и в конечном итоге утрачиваться в потомстве. Конъюгация — однонаправленная передача генетической информации в результате непосредственного контакта между донорной и реципиентной клетками.
Необходимым условием для конъюгации является наличие у бактерии- донора F-плазмиды (полового фактора), которая контролирует синтез половых ворсинок (sex-pili). Бактерии, имеющие F-плазмиду, называются мужскими (F+) клетками. Женские (F-) клетки не имеют этой плазмиды. Процесс конъюгации между F+и F- клетками имеет следующие стадии:
1) установление контакта между донором и реципиентом с помощью половых ворсинок;
2) прохождение генетического материала через канал половой ворсинки от донора к реципиенту;
3) рекомбинация между донорской и реципиентной ДНК.
ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ УЧЕНИЯ О ГЕНЕТИКЕ МИКРООРГАНИЗМОВ
Генная инженерия в медицинской микробиологии
Продукты, получаемые генно-инженерным способом с помощью рекомбинантных штаммов бактерий:
• вакцины;
• гормоны;
• интерфероны;
• цитокины.
Генетические методы, применяемые в микробиологической диагностике:
• процентное содержание Г+Ц бактериальном геноме;
• метод молекулярной гибридизации;
• полимеразная цепная реакция (ПЦР).
Полимеразная цепная реакция. Цели:
• обнаружение в патологическом материале конкретного вида микроорганизма без выделения чистой культуры;
• идентификация микроорганизмов;
• генотипирование микроорганизмов.
Этапы проведения ПЦР:
• выделение ДНК из патологического материала;
• добавление праймеров (участки ДНК, комплементарные 3’-концам искомого гена), добавление ДНК-полимеразы и нуклеотидов;
• нагревание;
• расплетение ДНК на две нити;
• охлаждение;
• связывание праймеров с комплементарными участками искомого гена;
• нуклеотиды присоединяются к 3’-концам праймеров, ДНК- полимераза достраивает вторые цепочки ДНК;
• повторение циклов (30-50) - накопление (амплификация) искомого гена;
• резкое нарастание (двукратное после каждого цикла) количества искомого гена;
• определение продуктов ПЦР с помощью электрофореза.
Еще по теме Лекция 4 Бактериофаги. Генетика микроорганизмов.:
- Особенности генетики микроорганизмов
- ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ
- Лекция 6 Экология микроорганизмов
- Лекция 3 Физиология микроорганизмов. Метаболизм бактерий.
- Лекция 1 Микробиология: предмет, задачи, объекты изучения. Исторические этапы развития микробиологии. Систематика, номенклатура, классификация микроорганизмов.
- Бактериофаги
- Глава 7. ГЕНЕТИКА ВИРУСОВ
- Цель и специфика моральных проблем генетики
- Генетика и евгеника
- Генетика вирусов
- Генетика атопии и атопического дерматита
- Тема 7. Моральные проблемы медицинской генетики
- Морально-этические и правовые проблемы генетики
- Дыхание микроорганизмов
- Санитарно-показательные микроорганизмы
- Систематика и номенклатура микроорганизмов
- Экология микроорганизмов