Культивирование и индикация вирусов
Культивирование вирусов человека проводят с целью лабораторной диагностики вирусных инфекций, для изучения вопросов патогенеза и иммунитета, для получения диагностических и вакцинных препаратов.
Так как вирусы абсолютные паразиты, то их культивируют в организме или в живых клетках.Для культивирования вирусов используют лабораторных животных, развивающиеся куриные эмбрионы, культуры клеток.
Лабораторных животных разными способами заражают (учитывают тропизм вирусов: ортомиксовирусами заражают интраназально, нейровирусами - субдурально). На основании типичных признаков заболевания и патоморфологических изменений органов животных можно судить о репродукции вирусов, т.е. проводить индикацию вирусов.
Куриный эмбрион является удобной моделью для культивирования вирусов, т.к. полости его стерильны, защищены твердой оболочкой. Индикацию вируса в курином эмбрионе проводят: по гибели эмбриона; помутнению хорион-аллантоисной оболочки; образованию бляшек на оболочке; в реакции гемагглютинации (происходит склеивание эритроцитов под действием гемагглютинина вирусов, который расположен в шипах суперкапсида).
Метод культур клеток. Для приготовления культур клеток используют различные ткани человека и животных. Чаще применяют культуры клеток из эмбриональных (куриные фибробласты, человеческие фибробласты) и опухолевых (злокачественно перерожденных) тканей, обладающих активной способностью к росту и размножению.
Различают три типа культур клеток: однослойные культуры клеток; культуры суспензированных клеток; органные культуры.
Однослойные культуры клеток по числу жизнеспособных генераций разделяют на первичные или первично трипсинизированные (куриные фибробласты, человеческие фибробласты); перевиваемые (способны размножаться в лабораторных условиях длительное время); полуперевиваемые (способны размножаться в течение 40-50 пассажей).
Для культивирования клеток необходимы питательные среды, которые по своему назначению делятся на ростовые и поддерживающие. В составе ростовых питательных сред должно содержаться больше питательных веществ, чтобы обеспечить активное размножение клеток для формирования монослоя. Поддерживающие среды должны обеспечивать лишь переживание клеток в уже сформированном монослое при размножении в клетке вирусов.
Широкое применение находят стандартные синтетические среды, например, синтетическая среда 199 и среда Игла. Независимо от назначения все питательные среды для культур клеток конструируются на основе сбалансированного солевого раствора. Чаще всего им является раствор Хенкса. Неотъемлемый компонент большинства ростовых сред - наличие 5-10 % сыворотки крови животных (телячьей, бы- чей, лошадиной), без наличия которой размножение клеток и формирование монослоя не происходит. В состав поддерживающих сред сыворотка не входит.
Культуры суспензированных клеток растут и размножаются во взвешенном состоянии при постоянном интенсивном перемешивании среды. Они используются для накопления вирусов.
Некоторые вирусы размножаются в органных культурах - это кусочки органов, выращенные вне организма и сохраняющие структуру данного органа.
Оразмножении вируса в культуре клеток судят по следующим признакам: цитопа- тогенному действию (ЦПД); образованию в клетках включений; появлению бляшек; феномену гемадсорбции; цветной пробе.
Цитопатогенное действие может проявляться полной дегенерацией клеток - слущиванием клеток с поверхности стекла после их гибели (энтеровирусы полиомиелита, Коксаки); частичной дегенерацией - округлением клеток, слиянием и образованием симпластов (вирус кори).
Образование включений в клетках - это скопление вирионов или отдельных компонентов в цитоплазме или в ядре клеток, выявляемые под микроскопом при специальном окрашивании. Вирус натуральной оспы образует цитоплазматические включения - тельца гварниери, вирусы герпеса, аденовирусы - внутриядерные включения.
Появление бляшек - зоны клеток, разрушенных вирусом (негативные колонии вирусов), обнаруживают в клеточных культурах, растущих на стекле и покрытых тонким слоем агара. Бляшки различаются по величине, форме, времени появления, поэтому данный тест используют для дифференциации вирусов.
Реакция гемадсорбции заключается в способности клеток, зараженных вирусами, адсорбировать на своей поверхности эритроциты, потому что эти клетки несут на поверхности гемагглютинины вируса.
Цветная реакция основана на изменении цвета питательной среды с индикатором, используемой для культур клеток. При росте клеток, не пораженных вирусом, идет накопление продуктов метоболизма, которые изменяют цвет питательной среды.
При репродукции вирусов в культуре нарушается метаболизм клеток, и среда сохраняет первоначальный цвет.
При отсутствии ЦПД можно поставить реакцию интерференйии - исследуемая культура повторно заражается вирусом, вызывающим ЦПД. В положительном случае ЦПД будет отсутствовать (реакция интерференции положительная), если в исследуемом материале вируса не было, наблюдается ЦПД.
Лабораторная диагностика вирусных инфекций. Используют методы экс- пресс-диагностики для обнаружения возбудителя или его антигенов в клиническом материале (ИФА, РИА, метод молекулярной гибридизации, ИФА, ПЦР, ВИЭФ, РПГА, электронной микроскопии, иммуно электронной микроскопии).
Выделение вируса и его индикацию и идентификацию проводят в вирусологическом методе диагностики. С этой целью необходимо обеспечить взятие материла от больного, правильную транспортировку его в лабораторию и грамотного заполнения сопроводительных документов. Выделение вируса из клинического материала проводят путем заражения культур клеток куриных эмбрионов и лабораторных животных. Индикацию вирусов проводят по гибели эмбрионов, постановке РГА, ЦПД в культуре клеток.
Идентификацию вирусов проводят с помощью серологических методов (постановки РТГА, РСК, ИФА, РИА, РН). Серологическая диагностика вирусных инфекций проводится с парными сыворотками больного, взятыми в острой фазе заболевания и через 10-14 дней. Обнаружение четырехкратного и более повышения титра антител рассматривается как диагностический признак острой вирусной инфекции.
Принципы химиотерапии и химипрофилактики вирусных инфекций. Мишенью действия противовирусных препаратов являются процессы адсорбции, проникновения вируса в клетку, депротеинизации, транскрипции, репликации и сборки вирусов.
1. Аномальные нуклеозиды ингибируют функции вирусных полимераз (иоддез- оксиуредин, ацикловир при лечении герпеса).
2. Производные адамантамина гидрохлорида. Ремантадин ингибирует репролук- цию вирусов гриппа, кори, краснухи
3. Тиосемикарбазон подавляет синтез вирусных белков и сборки вирусных частиц, активен против вирусов натуральной оспы.
4. Ингибиторы протеаз (гордокс, контрикал, аминокапроновая кислота).
5. Нарушают синтез вирусных белков - интерфероны.
4.5.
Еще по теме Культивирование и индикация вирусов:
- МЕТОДЫ ИНДИКАЦИИ КИШЕЧНЫХ ВИРУСОВ В ВОДЕ РАЗЛИЧНОЙ СТЕПЕНИ ЗАГРЯЗНЕНИЯ
- ИНДИКАЦИЯ ВИРУСНЫХ АЭРОЗОЛЕЙ
- Индикация специфических взаимодействий моноклональных антител с мононуклеарными клетками крови
- Лекция 23 Вирусы — возбудители ОРВИ: ортомиксовирусы, парамиксовирусы, коронавирусы, вирус краснухи.
- Лекция 28 ДНК-геномные вирусы. Онкогенные вирусы.
- Общие сведения о вирусе папилломы человека. Классификация папилломавирусной инфекции. Пути передачи вируса.
- ВИРУС ОСПЫ ОБЕЗЬЯН И СХОДНЫЕ ВИРУСЫ
- РЕСПИРАТОРНО-СИНЦИТИАЛЬНЫЙ ВИРУС (РС-ВИРУС)
- Глава 2. ПРИРОДА И ПРОИСХОЖДЕНИЕ ВИРУСОВ ПРИРОДА ВИРУСОВ
- Гепатотропные вирусы
- ЦИТОПАТОЛОГИЯ ЗАРАЖЕННОЙ ВИРУСОМ КЛЕТКИ
- ОТКРЫТИЕ ВИРУСОВ
- ВЫДЕЛЕНИЕ ВИРУСОВ ИЗ ВОЗДУХА ЗАКРЫТЫХ ПОМЕЩЕНИИ
- МОРФОГЕНЕЗ ВИРУСОВ
- ВИРУСЫ МАРБУРГ И ЭБОЛА
- ВИРУС ГЕПАТИТА НИ А НИ В
- Генетика вирусов
- КЛАССИФИКАЦИЯ ВИРУСОВ ГРИППА