<<
>>

Культивирование и индикация вирусов

Культивирование вирусов человека проводят с целью лабораторной диагностики вирусных инфекций, для изучения вопросов патогенеза и иммунитета, для получения диагностических и вакцинных препаратов.

Так как вирусы абсолютные паразиты, то их культивируют в организме или в живых клетках.

Для культивирования вирусов используют лабораторных животных, развиваю­щиеся куриные эмбрионы, культуры клеток.

Лабораторных животных разными способами заражают (учитывают тропизм вирусов: ортомиксовирусами заражают интраназально, нейровирусами - субдураль­но). На основании типичных признаков заболевания и патоморфологических измене­ний органов животных можно судить о репродукции вирусов, т.е. проводить индика­цию вирусов.

Куриный эмбрион является удобной моделью для культивирования вирусов, т.к. полости его стерильны, защищены твердой оболочкой. Индикацию вируса в курином эмбрионе проводят: по гибели эмбриона; помутнению хорион-аллантоисной оболоч­ки; образованию бляшек на оболочке; в реакции гемагглютинации (происходит скле­ивание эритроцитов под действием гемагглютинина вирусов, который расположен в шипах суперкапсида).

Метод культур клеток. Для приготовления культур клеток используют различ­ные ткани человека и животных. Чаще применяют культуры клеток из эмбриональных (куриные фибробласты, человеческие фибробласты) и опухолевых (злокачественно перерожденных) тканей, обладающих активной способностью к росту и размноже­нию.

Различают три типа культур клеток: однослойные культуры клеток; культуры суспензированных клеток; органные культуры.

Однослойные культуры клеток по числу жизнеспособных генераций разделяют на первичные или первично трипсинизированные (куриные фибробласты, человече­ские фибробласты); перевиваемые (способны размножаться в лабораторных условиях длительное время); полуперевиваемые (способны размножаться в течение 40-50 пас­сажей).

Для культивирования клеток необходимы питательные среды, которые по свое­му назначению делятся на ростовые и поддерживающие. В составе ростовых пита­тельных сред должно содержаться больше питательных веществ, чтобы обеспечить активное размножение клеток для формирования монослоя. Поддерживающие среды должны обеспечивать лишь переживание клеток в уже сформированном монослое при размножении в клетке вирусов.

Широкое применение находят стандартные синтетические среды, например, синтетическая среда 199 и среда Игла. Независимо от назначения все питательные среды для культур клеток конструируются на основе сбалансированного солевого раствора. Чаще всего им является раствор Хенкса. Неотъемлемый компонент боль­шинства ростовых сред - наличие 5-10 % сыворотки крови животных (телячьей, бы- чей, лошадиной), без наличия которой размножение клеток и формирование монослоя не происходит. В состав поддерживающих сред сыворотка не входит.

Культуры суспензированных клеток растут и размножаются во взвешенном со­стоянии при постоянном интенсивном перемешивании среды. Они используются для накопления вирусов.

Некоторые вирусы размножаются в органных культурах - это кусочки органов, выращенные вне организма и сохраняющие структуру данного органа.

Оразмножении вируса в культуре клеток судят по следующим признакам: цитопа- тогенному действию (ЦПД); образованию в клетках включений; появлению бляшек; фе­номену гемадсорбции; цветной пробе.

Цитопатогенное действие может проявляться полной дегенерацией клеток - слущиванием клеток с поверхности стекла после их гибели (энтеровирусы полиомие­лита, Коксаки); частичной дегенерацией - округлением клеток, слиянием и образова­нием симпластов (вирус кори).

Образование включений в клетках - это скопление вирионов или отдельных компонентов в цитоплазме или в ядре клеток, выявляемые под микроскопом при спе­циальном окрашивании. Вирус натуральной оспы образует цитоплазматические включения - тельца гварниери, вирусы герпеса, аденовирусы - внутриядерные вклю­чения.

Появление бляшек - зоны клеток, разрушенных вирусом (негативные колонии вирусов), обнаруживают в клеточных культурах, растущих на стекле и покрытых тон­ким слоем агара. Бляшки различаются по величине, форме, времени появления, по­этому данный тест используют для дифференциации вирусов.

Реакция гемадсорбции заключается в способности клеток, зараженных вируса­ми, адсорбировать на своей поверхности эритроциты, потому что эти клетки несут на поверхности гемагглютинины вируса.

Цветная реакция основана на изменении цвета питательной среды с индикато­ром, используемой для культур клеток. При росте клеток, не пораженных вирусом, идет накопление продуктов метоболизма, которые изменяют цвет питательной среды.

При репродукции вирусов в культуре нарушается метаболизм клеток, и среда сохра­няет первоначальный цвет.

При отсутствии ЦПД можно поставить реакцию интерференйии - исследуемая культура повторно заражается вирусом, вызывающим ЦПД. В положительном случае ЦПД будет отсутствовать (реакция интерференции положительная), если в исследуе­мом материале вируса не было, наблюдается ЦПД.

Лабораторная диагностика вирусных инфекций. Используют методы экс- пресс-диагностики для обнаружения возбудителя или его антигенов в клиническом материале (ИФА, РИА, метод молекулярной гибридизации, ИФА, ПЦР, ВИЭФ, РПГА, электронной микроскопии, иммуно электронной микроскопии).

Выделение вируса и его индикацию и идентификацию проводят в вирусологиче­ском методе диагностики. С этой целью необходимо обеспечить взятие материла от больного, правильную транспортировку его в лабораторию и грамотного заполнения сопроводительных документов. Выделение вируса из клинического материала прово­дят путем заражения культур клеток куриных эмбрионов и лабораторных животных. Индикацию вирусов проводят по гибели эмбрионов, постановке РГА, ЦПД в культуре клеток.

Идентификацию вирусов проводят с помощью серологических методов (поста­новки РТГА, РСК, ИФА, РИА, РН). Серологическая диагностика вирусных инфекций проводится с парными сыворотками больного, взятыми в острой фазе заболевания и через 10-14 дней. Обнаружение четырехкратного и более повышения титра антител рассматривается как диагностический признак острой вирусной инфекции.

Принципы химиотерапии и химипрофилактики вирусных инфекций. Ми­шенью действия противовирусных препаратов являются процессы адсорбции, про­никновения вируса в клетку, депротеинизации, транскрипции, репликации и сборки вирусов.

1. Аномальные нуклеозиды ингибируют функции вирусных полимераз (иоддез- оксиуредин, ацикловир при лечении герпеса).

2. Производные адамантамина гидрохлорида. Ремантадин ингибирует репролук- цию вирусов гриппа, кори, краснухи

3. Тиосемикарбазон подавляет синтез вирусных белков и сборки вирусных ча­стиц, активен против вирусов натуральной оспы.

4. Ингибиторы протеаз (гордокс, контрикал, аминокапроновая кислота).

5. Нарушают синтез вирусных белков - интерфероны.

4.5.

<< | >>
Источник: Новиков Д.К., Генералов И.И., Данющенкова Н.М. и др.. Медицинская микробиология. Витебск, 2010. 2010

Еще по теме Культивирование и индикация вирусов:

  1. МЕТОДЫ ИНДИКАЦИИ КИШЕЧНЫХ ВИРУСОВ В ВОДЕ РАЗЛИЧНОЙ СТЕПЕНИ ЗАГРЯЗНЕНИЯ
  2. ИНДИКАЦИЯ ВИРУСНЫХ АЭРОЗОЛЕЙ
  3. Индикация специфических взаимодействий моноклональных антител с мононуклеарными клетками крови
  4. Лекция 23 Вирусы — возбудители ОРВИ: ортомиксовирусы, парамиксовирусы, коронавирусы, вирус краснухи.
  5. Лекция 28 ДНК-геномные вирусы. Онкогенные вирусы.
  6. Общие сведения о вирусе папилломы человека. Классификация папилломавирусной инфекции. Пути передачи вируса.
  7. ВИРУС ОСПЫ ОБЕЗЬЯН И СХОДНЫЕ ВИРУСЫ
  8. РЕСПИРАТОРНО-СИНЦИТИАЛЬНЫЙ ВИРУС (РС-ВИРУС)
  9. Глава 2. ПРИРОДА И ПРОИСХОЖДЕНИЕ ВИРУСОВ ПРИРОДА ВИРУСОВ
  10. Гепатотропные вирусы
  11. ЦИТОПАТОЛОГИЯ ЗАРАЖЕННОЙ ВИРУСОМ КЛЕТКИ
  12. ОТКРЫТИЕ ВИРУСОВ
  13. ВЫДЕЛЕНИЕ ВИРУСОВ ИЗ ВОЗДУХА ЗАКРЫТЫХ ПОМЕЩЕНИИ
  14. МОРФОГЕНЕЗ ВИРУСОВ
  15. ВИРУСЫ МАРБУРГ И ЭБОЛА
  16. ВИРУС ГЕПАТИТА НИ А НИ В
  17. Генетика вирусов
  18. КЛАССИФИКАЦИЯ ВИРУСОВ ГРИППА