<<
>>

Методы исследования лимфоцитов периферической крови

2.4.1 Выделение мононуклеаров

Мононуклеары выделяли из периферической крови (ПК), стабилизированной гепарином в концентрации 25 ЕД на 1 мл, стандартным методом по Boyum на градиенте плотности для лимфоцитов Ficoll-Paque (р=1.077 г/см3) производства Amersham Biosciences (Швеция).

Кровь разбавляли физраствором 1:1, затем наслаивали в центрифужные пробирки на слой градиента. Центрифугировали при 1500 об/мин в течении 45 мин. Кольцо мононуклеарных клеток на границе градиента собирали и отмывали физраствором два раза по 5-7 мин при 1000 об/мин.

2.4.2 Получение основных субпопуляций Т-лимфоцитов

Выделение субпопуляций CD4+ и CD8+ Т-лифоцитов из фракции мононуклеарных клеток осуществляли методом магнитной сепарации. Для этого, согласно методике производителя (Miltenyi Biotech, Германия), к суспензии мононуклеарных клеток добавляли магнитные частицы, конъюгированные с анти-CD4 и анти-CD8 антителами соответственно, и инкубировали в течении 15 мин при +40°С. Затем клетки отмывали и осуществляли выделение позитивных фракций с помощью магнитного сепаратора AutoMACS (Miltenyi Biotech, Германия). Чистота выделения во всех случаях составляла более 95%.

Оценку морфофункционального состояния лимфоцитов проводили на основе аппаратно-программного комплекса БИОНИ (АПК БИОНИ) методами компьютерной цитоморфометрии (модуль компьютерной фазово­интерференционной микроскопии «Биони-КФМ») и микроэлектрофореза (модуль микроэлектрофореза «Биони-МЭФ»), в качестве референтных методов оценки состояния ядерных структур лимфоцитов использовали конфокальную микроскопию клеток и метод ФГА-стимуляции.

2.4.3 Метод витальной компьютерной фазометрии лимфоцитов

Взвесью клеток заполняли камеру Горяева, рабочая поверхность которой имела зеркальное напыление. После 3-5 минутного интервала, необходимого для оседания клеток, производили съемку изучаемых цитообъектов.

Оптимальный объем выборки составлял 100 клеток. Для проведения исследований использовали штатный 30-кратный микрообъектив с числовой аппертурой 0,65. Увеличение в канале регистрации составляло 500 х.

В основе принципа действия микроскопа, содержащего идентичные объективы в сигнальном и реперном плечах, лежит сравнение волнового фронта, прошедшего через объект, с опорным, отраженным от

высококачественного зеркала. Преобразование сигнала состоит в его дискретизации с последующей записью распределения фаз в виде цифровой матрицы ax,y, размером mxn, где m - число строк, n - число столбцов. Значения ax,y представляют собой оптическую толщину объекта Н в точке с координатами x,y: H(X,Y)=[n(x,y)-nc]h(x,y),

где n(x,y) - показатель преломления, h(x,y) - физическая толщина в

направлении Z, nc - показатель преломления среды (Рис.2).

Рис. 2.2. Модуль АПК БИОНИ для морфометрических цитологических исследований «Биони-КФМ» (А), оптическая схема (В).

Результат обратного преобразования цифрового массива в видимое изображение и восстановление фазового портрета объекта отображался на экране монитора компьютера. Количественный анализ данных производили отдельно с помощью программных средств, разработанных в среде MATLAB. Интерферограммы обрабатывали и сохраняли фазовые изображения клеток. Для каждой клеточной популяции оценивали морфометрические параметры: средние значения диаметра, периметра, высоты, площади и объема клеток. Результаты расчетов представляли в виде таблицы параметров каждого объекта и серии графиков.

Гетерогенность популяции оценивали по ИА-индексу асимметричности (Skewness). Его значение стремится к нулю в том случае, когда распределение в группе является симметричным (нормальным); высокое значение параметра свидетельствует о неравномерности распределения.

Ядерный полиморфизм циркулирующей популяции лимфоцитов характеризовали с использованием показателя функциональной активности ядра (FAN - functional activity of the nucleus) как величины обратно пропорциональная фазовой высоте (PH) каждой клетки в выборке по формуле:

FAN=(3*n3+2*n2+n1+O*no)∕n,

где FAN — функциональная активность ядра; n3- количество клеток с PH ^,5мкм; n2- с PH >1,5, но ≤2мкм; n1- с PH >2, но ≤2,5мкм; n0- с PH >2,5; n - число клеток в выборке.

Таким образом, чем выше анизотропия хроматина и, соответственно, фазовая высота, тем ниже активность ядра.

2.4.4 Метод компьютерного микроэлектрофореза лимфоцитов

При проведении исследований на модуле микроэлектрофореза «Биони-

МЭФ» пробы клеток помещали в 0,3 М раствор сахарозы, с помощью дозатора (около 40 мкл взвеси клеток) заполняли электрофоретическую камеру (Рис.3).

Рис. 2.3. Модуль АПК БИОНИ для электрофоретических цитологических исследований «Биони-МЭФ» (А), электрофоретическая ячейка (В).

На электроды камеры подавали напряжение, пронаблюдали 2-3 полных колебания клеток, производили запись клеточного микроэлектрофореза в 3 пробах для каждого образца. Для каждой клеточной популяции оценивали электрокинетические параметры:

- среднее значение амплитуды колебаний и ее стандартное отклонение;

- долю неподвижных клеток относительно их общего количества;

- количество пригодных к обработке клеток.

2.4.5 Конфокальная микроскопия лимфоцитов

Конфокальную микроскопию лимфоцитов проводили при помощи лазерного сканирующего конфокального микроскопа LSM 710 (Carl Zeiss, Германия), смонтированного на базе инвертированного универсального исследовательского микроскопа Observer.Z1 (Carl Zeiss, Германия). Использовали высокоапертурный объектив масляной иммерсии Plan­Apochromat 63x∕1.40.

Параметры регистрации: Возбуждение: гелий-неоновый лазер 488 нм. Регистрацию сигнала проводили по двум спектральным каналам: канал 1 (акридиновый оранжевый) в диапазоне 493-541 нм; канал 2 (бромистый этидий) в диапазоне 557-634 нм. Раз в 5 минут записывали стопку из 15-30 (в зависимости от толщины клеток) оптических срезов с шагом 400 нм по оси Z. Запись проводили в течение 30-60 минут.

Регистрировали интактные клетки и клетки после добавления индуктора активации (фитогемагглютинина). Результаты регистрации записывали и обрабатывали программами ZEN2010 (Carl Zeiss) и Imaris (B^lane).

2.4.6 Метод ФГА-стимуляции лимфоцитов

Стимуляция лимфоцитов периферической крови человека с помощью фитогемагглютинина (ФГА-стимуляция) является общепризнанным методом, используемым для определения способности лимфоцитов к пролиферации.

Культивирование лимфоцитов с ФГА проводили в 96-луночных планшетах при концентрации клеточной взвеси 1х106 лимфоцитов в 1 мл среды при 37°С. В лункт помещали по 200 мкл культуры, используя 6 дублирующих лунок. Лиофилизированный препарат ФГА (Phytohemagglutinin-P, «Difco», США) разводили согласно инструкции, использовали в конечной концентрации 50 мкг/мл, добавляя по 20 мкл в каждую лунку; в контрольные пробы ФГА не вносили. Клетки культивировали в двух дублирующих планшетах: для определения количества и жизнеспособности лимфоцитов и для определения пролиферативной активности с 3Н-тимидином. Клетки исследовали до начала стимуляции, через 24 и 48 часов от начала культивирования.

Количество жизнеспособных клеток подсчитывали по окраске 1% трипановым синим и выражали в процентах от общего количества клеток.

При определении пролиферативной активности лимфоцитов за 3 часа до окончания культивирования в лунки добавляли 3Н-тимидин в объеме 20 мкл на лунку в конечной концентрации в культуре 5 мкКи/мл (200 кБк/мл). затем клетки переносили на нитроцеллюлозные фильтры и после высушивания помещали во флакончики с сцинтилляционной жидкостью (high-safe, «Wallac», Финляндия). Радиоактивность пробопределяли на жидкостном сцинтилляционном 3-счетчике («Beckman», США) и выражали в импульсах в 1 мин. Уровень пролиферативной активности лимфоцитов определяли по интенсивности включения 3Н-тимидина в ДНК пролиферирующих клеток (в имп/мин), на основании чего рассчитывали индекс стимуляции (ИС):

ИС= количество импульсов в 1 мин с ФГА

Количество импульсов в 1 мин без ФГА

2.4.7 Метод проточной цитофлюорометрии лимфоцитов

Методом двухцветной проточной цитофлюориметрии определяли поверхностный фенотип иммунокомпетентных клеток (FACScan, Becton Dickinson, USA) с помощью моноклональных антител CD4 и CD 8

(МедБиоСпектр, Москва). В качестве флюорохромной метки использовали флюоресцеин изотиоционат (FITC) и фикоэритрин (РЕ). Процедуру окрашивания и фиксации клеток проводили стандартным способом в соответствии с указаниями фирмы-разработчика. При проведении проточной цитометрии клетки использовали в конечной концентрации 1x106.

2.3

<< | >>
Источник: ГАДЖИЕВА ЗЕМФИРА ШИХСЕФИЕВНА. КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ ЯДЕРНОГО ПОЛИМОРФИЗМА ЛИМФОЦИТОВ ПРИ АДЕНОМИОЗЕ (клинико-экспериментальное исследование). Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук. Москва - 2014. 2014

Еще по теме Методы исследования лимфоцитов периферической крови:

  1. Цитохимические и цитоморфологические методы исследования нейтрофильных гранулоцитов периферической крови
  2. 5.1. Сравнительная оценка морфометрических и электрокинетических показателей лимфоцитов крови при аденомиозе и лейомиоме матки
  3. Корреляционный анализ результатов исследования активации лимфоцитов, полученных методами КФМ и МЭФ
  4. 5.2. Методы имиджинга лимфоцитов в оценке эффективности лечения аденомиоза
  5. Исследование показателей липидного профиля сыворотки крови
  6. ИССЛЕДОВАНИЕ РАСТВОРИМЫХ ФОРМ МОЛЕКУЛ КОМПЛЕКСА ГИСТОСОВМЕСТИМОСТИ КЛАССА II В СЫВОРОТКЕ КРОВИ, МОКРОТЕ И КОНДЕНСАТЕ ВЫДЫХАЕМОГО ВОЗДУХА ПРИ ОБОСТРЕНИИ ХОБЛ
  7. ГАДЖИЕВА ЗЕМФИРА ШИХСЕФИЕВНА. КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ ЯДЕРНОГО ПОЛИМОРФИЗМА ЛИМФОЦИТОВ ПРИ АДЕНОМИОЗЕ (клинико-экспериментальное исследование). Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук. Москва - 2014, 2014
  8. Периферическая гемодинамика
  9. Лимфоциты
  10. 2.1 Периферический рак легкого
  11. Состояние периферического кровообращения
  12. ЭНДОТЕЛИАЛЬНАЯ ФУНКЦИЯ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ И ЦЕНТРАЛЬНОЙ ГЕМОДИНАМИКИ У БОЛЬНЫХ ЛЕГОЧНОЙ ГИПЕРТЕНЗИЕЙ
  13. Изучение динамики морфометрических показателей интерфазных ядер как маркеров активации лимфоцитов
  14. Изучение динамики электрокинетических показателей интерфазных ядер как маркеров активации лимфоцитов