2.2. Методы исследования.

Клинико-лабораторное обследование включало инструментальные методы - УЗИ, цветной допплер, кардиотокография в динамике, ЭКГ, ЭхоКГ; использовались такие лабораторные методы как клинический, биохимический анализы крови, общий анализ мочи, а также исследования системы гемостаза, в том числе генетические.

Ультразвуковое исследование при беременности и после родов проводилось на аппаратах «Aloka SSD-680», «Toshiba-38A» (Япония). Допплерометрическое исследование кровотока в системе мать-плацента-плод - на «Aloka» ССД-680 и «Aloka» ССД-2000 с использованием трансабдоминальных датчиков частотой 3,5 и 5,0 МГц в режиме пульсовой допплеровской волны. Антенатальная кардиотокография осуществлялась методом неинвазивного ультразвукового зондирования. Аппараты: 8030А фирмы «Hewlett Packard» (США), МТ-801 фирмы «Toitu» (Япония); монитор: «Феталгарт-2000»; персональный компьютер с математическим обеспечением анализа кардиотокограмм. Вычислялся интегрированный показатель состояния плода (ПСП) [Демидов В.Н. и соавт.,1983].

Гематологические показатели - количество RBC, концентрацию Hb в периферической крови, показатель Ht, MCV, MCH, MCHC, RDW определяли на приборе «Дигисел-800» (Швейцария). Количество ретикулоцитов подсчитывалось по стандартной методике (в камере Горяева, при окраске мазка крови бриллиантовым крезиловым синим).

Биохимические методы исследования. Материал исследования: сыворотка крови. Забор венозной крови проводился утром натощак, в одноразовые пробирки. Концентрацию СЖ (мкмоль/л) и ТФ (г/л) определяли на биохимическом анализаторе «Kone Ultra» (Финляндия) с использованием стандартных реактивов. Концентрацию СФ (мкг/л) определяли тест-системами для иммуноферментного анализа фирмы производителя: DiaSys Diagnostic Systems GmbH &Co. KG (Германия). В наборе использован турбидиметрический метод. Измерение осуществлялось на биохимическом анализаторе «Kone Ultra» (Финляндия) при 500-600 нм.

специальной формуле. Определение с-ЭПО производилось набором «Pro Con EPO24» (Санкт-Петербург, «Протеиновый контур»), твердофазным иммуноферментным методом с применением пероксидазы хрена в качестве индикаторного фермента. Оптическая плотность растворов измерялась на аппарате «FP-901» (фирмы Labsystems, Финляндия) при длине волны 450 нм. Оценивалась адекватность продукции ЭПО для данного уровня Hb как отношение логарифма наблюдаемого ЭПО к логарифму предполагаемого (коэффициент адекватности). Значение КА эпо от 0,8 до 1,2, указывает на адекватную продукцию ЭПО в ответ на ЖДА, 40.

7. Всем пациенткам с выявленной мутацией МТНБКС677Т проводилось определение концентрации гомоцистеина в плазме крови,

иммуноферментным методом с использованием реактивов Axis® фирмы Axis­Shield AS, Норвегия на приборе ANTOS 2020, США (табл. 11).

Таблица 11. Определение степени гипергомоцистеинемии.

6. Глобальная оценка функционирования системы протеина С осуществлялась коагулометрическим методом с использованием коммерческих наборов «Парус»-тест фирмы «Технология-Стандарт», Барнаул, Россия на приборе «START 4» (Stago, Франция).

7. Уровни PAI-1, АТ III и протеина С определялись методом синтетических хромогенных субстратов Stago, Франция на спектрофотометре с длиной волны 405 нм на приборе ST 88 Diagnostica Stago.

8. Выявление генетически обусловленных форм тромбофилии

Молекулярный анализ генетических дефектов гемостаза FV Leiden /1691G-A/, мутации гена фолатзависимого фермента метилентетрагидрофолатредуктазы MTHFR C677T, а также мутация в гене Pt G20210A выполнялась методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Основные этапы выявления генетических дефектов гемостаза включали: -выделение ДНК;

-амплификацию (методом ПЦР);

-рестрикцию.

Молекулярный анализ генетических дефектов FVLeiden /1691G-A/, MTHFRC677T, Pt 020210А выполнялся постановкой полимеразной цепной реакции. Этот метод амплификации ДНК in vitro обеспечивает выявление

даже незначительных изменений в генах. Принцип ПЦР заключается в циклической денатурации с образованием матричных цепей, гибридизации олигонуклеотидов, комплементарных синтезируемой ДНК и пр.

1.Определение мутации в гене С677Т в гене 5,10- метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR) человека методом ПЦР.

Мутация С677Т в гене MTHFR человека представляет собой замену остатка цитозина в положении 677 на остаток тимина.

В результате мутации изменяется последовательность аминокислот полипептидной цепи фермента, что делает его термолабильным, приводит к дефициту цитоплазматической MTHFR и повышению уровня гомоцистеина в плазме крови из-за подавления его метаболизма. С помощью ПЦР производится амплификация участка ДНК обследуемого пациента, изменяемого под действием мутации. При этом содержание амплифицируемого фрагмента ДНК в пробе увеличивается в ~10⁸раз по сравнению с исходным. Процесс амплификации совершается при повторных циклах температурной денатурации ДНК, отжига олигонуклеотидных праймеров на комплементарных последовательностях ДНК и последующей достройке полинуклеотидных цепей с этих праймеров термостабильной ДНК-полимеразой. Мутация С677Т приводит к образованию нового сайга рестрикции для рестриктазы HinfI. Поэтому рестриктаза может расщеплять в этом месте мутантный, но не нормальный продукт ПЦР. По окончании ПЦР образовавшийся фрагмент ДНК инкубируют с рестриктазой HinfI и продукты реакции анализируют электрофорезом в агарозном геле. При наличии мутации обнаруживают образование двух низкомолекулярных полос, образовавшихся под действием фермента. При этом полное расщепление продукта ПЦР свидетельствует о наличии в анализируемой ДНК гомозиготной формы мутации С677Т, а частичное - гетерозиготной (рис.

Продукты ПЦР становятся видимыми в 3% агарозном геле после прокрашивания бромистым этидием благодаря их флюоресценции в ультрафиолетовом свете. В результате полимеразной цепной реакции (38

циклов) образуется фрагмент ДНК длинной 205 нуклеотидных пар. Инкубация продукта ПЦР с рестриктазой HinfI не сопровождается его расщеплением при отсутствии мутации С677Т (дорожки 2 и 5 рис. 9), полное расщепление с образованием фрагментов ДНК длиной 116 и 79 пар нуклеотидов (дорожка 8), происходит при наличии гомозиготной формы мутации и при гетерозиготной мутации - частичное ращепление (дорожки 1, 3, 4, 6, 7, 9).

Рисунок 7. Молекулярный анализ мутации MTHFRC677T.

2. Определение мутации в гене фактора V Leiden свертывающей системы крови методом полимеразной цепной реакции.

Мутация Leiden в гене фактора V представляет собой замену остатка аденина в положении 1691 на остаток тимина. В результате мутации происходит замена Arg-506→Gln в полипептидной цепи FV. В результате ПЦР амплифицируется участок исследуемой ДНК, измененный под действием мутации. Мутация Leiden нарушает сайт рестрикции для рестриктазы Мп1. Поэтому рестриктаза может расщеплять в этом месте нормальный, но не мутантный продукт ПЦР. По окончании ПЦР образовавшийся фрагмент ДНК инкубируют с рестриктазой Мп1. При отсутствии мутации после электрофореза обнаруживают две низкомолекулярные полосы, образовавшиеся под действием фермента. Полная устойчивость продукта ПЦР к рестриктазе свидетельствует о

наличии в анализируемой ДНК гомозиготной мутации, а частичная - гетерозиготной формы (рис. 10).

Продукты ПЦР обнаруживаются в 3% агарозном геле после прокрашивания бромистым этидием по флюоресценции в ультрафиолетовом свете. При проведении ПЦР в пробах, содержащих ДНК человека, образуется фрагмент ДНК длинной 205 нуклеотидных пар. Инкубация продукта ПЦР с рестриктазой MnI сопровождается его полным расщеплением при отсутствии мутации Leiden. Расщепление отсутствует при наличии гомозиготной формы (дорожки 3 и 5, рис. 10), при гетерозиготной форме мутации - частичное расщепление (дорожки 7 и 13).

Рисунок 8. Молекулярный анализ мутации FVLeiden /1991G-A/.

3. Определение мутации G20210A в гене протромбина методом полимеразной цепной реакции.

Мутация ?Ю20210А представляет собой замену остатка гуанина в положении 20210 на остаток аденина, локализованного в его концевой некодирующей части. В результате мутации не изменяется последовательность аминокислот полипептидной цепи протромбина, однако увеличивается стабильность его м-РНК, что сопровождается повышением уровня синтеза протромбина и его концентрации в плазме крови. Мутация Г1:0020210А нарушает в ПЦР- продукте искусственный сайт рестрикции для рестриктазы Тац I, недостающие нуклеотиды которого вводятся в ПЦР- продукт с помощью одного из праймеров. Поэтому рестриктаза может

расщеплять в этом месте нормальный, но не мутантный амплифицированный фрагмент ДНК. При наличии гомозиготной мутации исходный продукт ПЦР не расщепляется ферментом. Полное расщепление продукта ПЦР свидетельствует об отсутствии мутации PtG20210Λ в анализируемой ДНК, а частичное - гетерозиготной формы мутации (рис. 11).

Продукты ПЦР обнаруживают в 4% агарозном геле после прокрашивания бромистым этидием по флюоресценции в ультрафиолетовом свете.

Хотя в мировой практике описывается гомозиготная форма мутации PtG20210Λ, нами были выявлены преимущественно гетерозиготные формы.

Инкубация продукта ПЦР с рестриктазой TaqI сопровождается его полнымрасщеплением пр отсутствии мутации, частичным при наличии гетерозиготной мутации(дорожки 1,4 и 8).

Рисунок 9. Молекулярный анализ мутации PtG20210A.

В процессе ПЦР-диагностики полиморфизма GP Ia использовалась рестриктаза HinfI, GP IIIa «1565 Т/С» - MspI, фибриногена «455 G/A» и рецептора ангиотензина II типа 1 «1166 А/С» - HaeIII, PAI-1 «675 4G/5G» - Bsc4I.

СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА ПОЛУЧЕННЫХ ДАННЫХ

Полученные данные были проанализированы и обработаны с применением параметрических (при нормальном распределении признака в выборках, а также в случаях, когда объем выборки >100) и непараметрических (при свободном распределении признака в выборках) методов оценки достоверности различий сравниваемых выборок. Различия между сравниваемыми выборками принимались достоверными при уровне значимости (р) менее 0,05. Расчет производили при помощи программы IBM® SPSS® Statistics Версия 19 .